微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇 二二.微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线三三.提高内生菌紫杉醇的产量的方法提高内生菌紫杉醇的产量的方法一、紫杉醇的概况和作用机制一、紫杉醇的概况和作用机制 红红豆豆杉杉树树一、紫杉醇的概况和作用机制一、紫杉醇的概况和作用机制 紫杉醇紫杉醇（（Paclitaxel,Paclitaxel,商品名商品名TaxolTaxol））的概述：的概述：Ø1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物 Ø1971年Wall 和Wani将粗提物进行纯化，并确定了其化学结构（一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol））Ø2001 年Huang Q 等通过实验获得紫杉醇生物合成的重要中间产物紫杉二烯( Taxadiene, 产量达13mg/L) , 成为基因工程菌合成紫杉醇中间体的先例Ø紫杉醇发现到临床应用大约经历了30 年的时间 注：紫杉醇是一种复杂的具有抗癌活性的三环二萜类生物碱。
二二 微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线•实验材料 罗汉松的树皮•实验方法1 1 内生真菌分离内生真菌分离2 2 内生真菌纯化、鉴定与保存内生真菌纯化、鉴定与保存3 3 发酵培养发酵培养4 4 发酵产物的处理发酵产物的处理（紫杉醇的提取、纯化、含量测定）（紫杉醇的提取、纯化、含量测定） 1 内生真菌分离•1）对植物组织表面进行消毒, 以控制表生真菌的生长, 使内生真菌得以分离其分离方法是先用水冲洗已剪碎的植物材料, 然后在75%乙醇中浸泡3min 后,最后用无菌水冲洗•2）分离所用的培养基为PDA 培养基为了防止细菌污染可在培养基中加抗菌素, 如链霉素、四环素等温箱中28 ℃培养3-4 d 后观察.•在分离内生真菌时常添加一些宿主植物的提取液，以满足内生真菌的一些特殊的营养需求 2 内生真菌纯化、鉴定与保存待培养基上初步长出菌落后，选择长势较好的菌落，挑取菌丝到PDA平板上纯化，根据经典形态学方法鉴定菌种纯化的菌株在PDA斜面4℃下保持，备用 3 发酵培养•从PDA 平板上切取5 mm × 5 mm 小块菌落,接种至装有150 mL 液体培养基的500 mL 三角瓶中, 于28 ℃ , 100 r/ min 摇床上振荡培养10-14 d. 4 发酵产物的处理发酵产物的处理 1）紫杉醇的提取）紫杉醇的提取•常用的有机溶剂：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等•提取原则：能够充分萃取出发酵液和菌丝中的紫杉醇•具体方法： •发酵液过滤后, 菌丝研磨（加适量石英砂），滤液称量体积。
•滤渣烘干( 低于50℃) ,滤渣用适量乙酸乙酯萃取, 滤液用1/2 滤液体积的乙酸乙酯萃取( 30min) , 下层水层再用乙酸乙酯萃取一次, 合并乙酸乙酯,减压蒸馏•用适量甲醇洗涤减压蒸馏得到的固体, 再用正己烷洗涤15min, 收集下层甲醇, 加入乙酸乙酯和水( 1：1) 进行萃取( 30min) , 将收集的乙酸乙酯进行减压蒸馏, 用一定量的乙腈洗下固体, 0 ℃密封保存 •2）紫杉醇的纯化）紫杉醇的纯化紫杉醇的纯化多采用色谱法已报道的用于紫杉醇分离的方法除薄层色谱法、柱层析法外还有胶束电动毛细管色谱法、高速逆流色谱法、树脂吸附分离法、膜分离法、沉淀法、化学反应法和药理作用靶点法 •3）紫杉醇含量测定）紫杉醇含量测定 真菌发酵液中紫杉醇的定量可采用薄层色谱(TLC) 、高效液相色谱高效液相色谱( HPLC) 、UV 免疫分析、生物学方法和放射性前体标记等 高效液相色谱高效液相色谱( HPLC) •HPLC 是最常用的、较为有效的分析检测方法HPLC 不仅可以测定紫杉醇含量, 而且还能追踪分离紫杉醇 •色谱条件：惠普1100系列，采用XDB-C18色谱柱(4.6mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇与水混合物(V甲醇:V水=65:35)，柱温为25℃，波长为227 nm，流速1.0 mL/min，进样量10μL。
用紫杉醇标准品做对照 •预期结果•从罗汉松树皮中成功筛选出一株产紫杉醇的内生真菌菌株 微生物发酵法生产紫杉醇的优势微生物发酵法生产紫杉醇的优势•内生真菌能在简单的培养基上良好生长•产生大量的发酵产物•发酵周期短•可以在生物反应器中人为控制各种参数•可通过诱变育种等手段来提高菌种性能，以提高紫杉醇产量 微生物发酵法生产紫杉醇微生物发酵法生产紫杉醇面临的困境面临的困境•（1）缺乏良好的适合发酵的工业菌株 •（2）由于发酵条件的限制，单位培养液中紫杉醇的含量低 三 提高内生菌紫杉醇的产量的方法提高内生菌紫杉醇的产量的方法（一）改良菌种1. 利用常规的诱变改良菌种 2. 利用原生质体融合改良菌种3. 利用基因工程构建工程菌 分离紫杉醇合成代谢酶类和获得它们的 cDNA 克隆，将已经构建的携带紫杉醇合成途径关键酶基因的真菌表达载体转入高产紫杉醇内生真菌中，获得高产紫杉醇工程菌株 （二）优化发酵条件1.培养基和培养条件的优化 依据不同产紫杉醇真菌的生长条件，选择合适的培养基，发现最佳发 酵条件，以期提高紫杉醇的产量 2.添加紫杉醇合成的前体物质 加入前体一方面可通过增加底物量来加快反应速度和提高产率，另一方面还能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行，有效提高紫杉醇产量。
如：钠不仅能掺入到乙酰基，而且能掺入到苯环及紫杉烷骨架中，是紫杉醇合成的有效前体 （二）优化发酵条件3.添加代谢产物的抑制剂 真菌的次生代谢产物十分丰富，估计有 3,000 多种，如果研究清楚紫杉醇与其他次生代谢物之间合成关系，对人为抑制其他次级代谢物的合成，能有效促进紫杉醇的生物合成量4.添加诱导物 诱导子是一类可以引起代谢途径改变或强度改变的物质，包括植物激素、无机离子、多糖、真菌培养物等 （三）与（三）与 “前提内生真菌前提内生真菌”一起培一起培养养 如产紫杉醇合成前体 10-去乙酰巴卡亭 III 和巴 卡亭 III 的内生真菌 。