质控DC细胞成熟度检测标准操作规程树突状细胞(DC)的主要功能是吸收抗原，进行加工，并向T淋巴细 胞呈递其它抗原呈递细胞也有此功能，如B淋巴细胞和单核细胞但是， 与其它细胞不同的是，DC细胞具有诱导初发免疫反应的独特功能，例如, 可以活化处女T细胞(Na?veTcell)o DC细胞存在于外周淋巴组织中，已 在血液和非淋巴器官中发现了不同类型的DC细胞，并被认为是淋巴组织 中细胞的前体由于血液和组织中DC细胞含量少，且缺乏特异的DC标记物，所以 DC细胞的研究非常困难因此，关于DC细胞的了解主耍来自于通过密度 梯度离心、培养、和/或阴性选择富集后的DC细胞的研究这些过程利用 了 DC细胞的密度和黏附特征，和在一定细胞因子条件下的选择性生长， 或缺乏淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的系列标记物的表达但是，这些方 法中DC细胞的产率和纯度较低，且费时费力而且，这些操作可以影响 细胞的功能，并且无法做DC细胞含量的定量分析最近的报告发现在活化DC细胞和血液或淋巴细胞分离培养的DC细胞 表面CD83和CMRF-44高表达CD83和CMRF-44可以作为DC细胞的活化 标志物，但在体内或未处理的细胞上没有特征性表达，或表达水平很低。
在对新鲜分离的DC细胞的研究中，发现IL-3R在淋巴器官的DC细胞上有 特异表达从人类外周淋巴组织中分离的单个核细胞中主耍是此类DC细 胞IL・3R (CD123)抗体可以用來进行免疫磁珠分选，从外周淋巴组织制备的单个核细胞样木中，将CD123+ DC细胞进行200倍富集CD123抗体 还可以用來做免疫组化分析，特异识别滤泡外T细胞富集区的CD1234- DCo 在外周血中也有CD123+ DC细胞，与以前所说的CDllc- DC细胞和 CD33dimCD14-CD16- DC细胞是同一类细胞由于缺乏DC特异性标记物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一 类细胞DC细胞既可以由成熟的外周血单核细胞生成，也可以由未分离的 CD34+干祖细胞经GM-CSF和TNF・?培养得到使用CD123抗体，发现有一群CD34+ DC样幼稚细胞这群细胞与CD34+干祖细胞的区别是可以发育成Langerhan 细胞样DC因此，根据CD123版本号：1.02013-10-08【目的】使用DC标记物建立起检测系统，对实验室培养的DC细胞进行定量检 测实验方法采用三色或四色流式细胞仪分析，检测速度快，样本用量少， 可以用來辅助研究在病理和生理条件下，DC在免疫调控中作用。
适用范围】本标准操作规程适用于细胞免疫治疗实验室所制备的DC细胞的质控 检测规定】木实验目的是从外周血中检测两种类型的DC细胞：CD123+ DC(Anti-IL-3R+)和 CDllc+ DCCDllc 和 CD123 并不是 DC 特异的标志物 两类细胞均HLA・DR高表达，单核细胞、淋巴细胞和NK细胞的系列标记物 弱表达因此使用单一荧光标记的LIN cocktail (LINl)抗体将DC细胞区分出來LIN1抗体包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20 和 CD56另外，本实验还可以区分嗜碱粒细胞嗜碱粒细胞的表型是：LIN1-CD123+HLA-DR-O使用HLA・DR可以区分嗜碱粒细胞和CD123+ DC细胞规程】1•材料与试剂1.1材料DC细胞样品(由DC组在刺激成熟完成后，进行冻存操作的当天提供) 移液器与枪头1.5mL ep 管BD流式管1.2试剂抗体：版本号：1.0 2013-10-08FACSbuffer(2% HABserum+PBS) 2.实验准备 2.1FACS buffer 的配1取50mL离心管加入49mLPBS,再加入ImL HAB serum,配成含2%serum 的 FACS buffero2.2BDFACS Calibur开机操作及上样前准备。
参考 44 BD FACSCalibur Instructions for usePage 55-58o 3•实验步骤 3.1将DC组提供的细胞悬液离心，2500rpmx5min,常温3.2弃去上清液,加入ImL FACS buffer吹匀细胞，2500rpm x 5min,常 温离心洗涤细胞3.3弃去上清液，加入400 P L FACS buffer吹匀细胞， 分装到4个1.5mLEP管里(每管100 UL),对应下表染抗体，每种抗体每次 加 2 U L：版本号：1.0 2013-10-081234 none CDllc FITC ・ CD86 APC CD80 PE ・ CD83 APC HLA-DR APC 作为 NC(negative control)检测样品 检测样品 检测样品注：由于实验设计将2、3号样品染色染料的吸收通道相距较远，故 不用进行调补偿操作3.4抗体加完，将各样品管混匀后，避光冰上孵育20mino3.5孵育完成,加入1000 U L FACS buffer混匀后，常温离心2500 rpmX5mi n3.6弃去上清液，加入1000 U L FACS buffer混匀后，常温离心 2500rpmX5mino3.7弃去上清液，加入400 U L FACS buffer混匀后，转入流式管中，上 机。
继续写完4.上机操作4.1开机 4丄1按以下顺序：开启稳压电源、流式细胞仪电源、电脑主机4.1.2打开细胞仪左侧的抽屉，确认鞘液筒冇八分满的鞘液，将废液筒 内废水清空并用84消毒水清洗4.1.3确认鞘液筒及废液筒的筒盖拧紧之后，将减压阀方向调在加压位 置（向外）4丄4执行PRIME功能两次，排除气泡4.2上机4.2.1打开电脑主机后,选择administrator用户选项,输入密码BDIS4.2.2双击设备“Data”，打开文件夹“458/DC”双击模板文件“Template forDC-maturity",打开为检测电转效率设计的流式检测模板此吋软件 CellQuest Pro自动启动，并弹出含4个检测散点图的面板窗口及任务浏览 器窗口 Browser untitle,如图所示版木号：1.0 2013-10-084.2.3在CellQuest Pro的工具栏中点击“Acquire”,在下拉菜单中点击 u Connect to Cytometer",连接细胞仪与检测软件，此吋电脑自动弹出 Acquisition Control 窗 口4.2.4在CellQuest Pro的工具栏中点击“Acquire”,在下拉菜单中点击 “Counters”,显示细胞计数器窗口。
4.2.5 同按 command+l> 2、3、4”,弹出 4 个调试窗口:版木号：1.0 2013-10-084.2.6在弹出的Detectros/Amps窗口中,将P1的Amp Gain调至5.6左 右，将Voltage调至E・l, P2的Voltage调至300左右427上样之前，先上一管纯水，再把样品支持架左移，使细胞仪真空 系统抽取约ImL水，再将样品架回正4.2.8 样品管Z前，先改对应样品管的名字及存储路径：在 “Data/458/DC”中新建格式为“年.月.H■病人姓名大写缩写・DC”例如 “2016.06.03・XXX・DC”作为该病人的储存文件夹4.2.9 先上 NC 管样品，将 Acquisition Control 窗口中的 “setup”打钩, 如图点击“Acquire",开始收集细胞信号，在FSC-SSC Dot Plot中调试好 gate,使DC细胞群在gate中,如图4.2.10 调电压调节 Detectros/Amps 窗口中 P3、P4> P7 的 Voltage 使 除FSC-SSC散点图外的各散点图的NC DC细胞群处于100-101区间，如下 图。
调节完毕，将将Acquisition Control窗口中的“setup"打钩去掉，退 出设置模式，并点击“Acquire"跑样，结果作为NC,实验数据自动保存调电压前 调电压后版本号：1.0 2013-10-084.2.10将实验组的各管依次上样，当上一管上样完毕后，须在下一管 上样Z前使机器真空抽取约ImL水以清洗管道，并将样品名称改为下一管 对应的名称，再上下一管样品4.3关机4.3.1最后一管样品上样获取完毕后，将样品支持架左移，取2mLFACSCIean(10%Bleach)样品，让仪器的真空系统抽取约ImL液体4.3.2将样品支持架回正，按HI、RUN,然后让FACSCIean清洗管路2 分钟4.3.3 取 2mL dH2O,重复步骤 4.3.1432434按STANDBY. L0,保持十分钟，使风扇冷却镭射后，关闭细胞仪 与稳压电源435将减压阀放在放气位置，将鞘液桶充填至8分满4.3.6将实验数据用U盘拷贝退出软件，点击Cell Quest Pro-Quit”， 在弹出对话框选择“Do『 tSaveo并关闭计算机附件】《质控DC细胞成熟度检测报告》版本号：1.0 2013-10-08。