ICS 67 ． 140 ． 10X 55 雪亘中华人民共和国国家标准GB／T 23 1 93—2008茶叶中茶氨酸的测定 高效液相色谱法 Determination of theanine in tea--High performance liquid chromatography2008—12-31发布 2009 —06-0 1实施宰瞀鹊紫瓣警襻瞥鐾发 中国国家标准化管理委员会 “” GB／T 23193—2008 刖 昌本标准的附录 A为资料性附录 本标准由国家食品质量安全监督检验中心提出 本标准由全国茶叶标准化技术委员会归口 本标准起草单位：国家食品质量安全监督检验中心、国家茶叶质量监督检验中心 本标准主要起草人：刘小力、石维妮、周卫龙、金瑛、徐建峰、刘晓毅、李想GB ／ T 23193—2008茶叶中茶氨酸的测定 高效液相色谱法1范围 本标准规定了用高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸含量的方法本标准适用于茶叶中茶氨酸的测定 本标准检出限为 5． 0 mg／ kg2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单 (不包括勘误的内容 )或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准GB／ T 6682 2008 分析实验室用水规格和试验方法 (ISO 3696 ： 1987 ， MOD)GB ／ T 8302 茶取样GB／ T 8303 2002 茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定 (eqv ISO 1572 ： 1980)3原理 茶叶样品中茶氨酸经水加热提取、净化脱色、衍生化处理后，采用高效液相色谱仪进行测定，与标准系列比较定量4试剂除非另有说明，在分析中所使用试剂均为分析纯，用水为 GB／ T 6682 2008 规定的三级水4． 1茶氨酸标准品 (L-theanine) ：纯度 ≥99 ％4． 2邻苯二甲醛 (OPA) 4． 3乙硫醇4． 4硼酸4． 5氢氧化钠4． 6乙腈：色谱级4． 7甲醇：色谱级4．8 0． 45“m 无机滤膜4．9 C固相萃取柱4． 10乙酸铵溶液 (20 mmol／ L)：称取 1． 54 g乙酸铵，用水溶解定容至 1 000 mL4．11 硼酸钠缓冲液 (0． 4 mol／L)：称取2．48 g硼酸和 1． 41 g氢氧化钠，用水溶解定容至 100 mL 4． 12衍生试剂：称取 0． 1 g OPA 用 10 mL甲醇溶解，加 0． 1 mL乙硫醇，用 0． 4 mol ／ L硼酸钠缓冲液 定容至 100mL 。
4． 13茶氨酸标准储备液：称取 0． 05 g茶氨酸 (精确到 0． 000 1 g)，用水溶解后移人 50 mL容量瓶中， 稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升含 1 mg茶氨酸有效期为一年4． 14茶氨酸标准使用液：分别准确吸取茶氨酸标准储备液 (1 mg／ mL)0 ． 0、 0． 1、 0． 2、 0． 5、 1． 0、 1． 5、2．0 mL，用水定容至 10 mL，得到浓度分别为 0． 0、 0． 01、 0． 02、 0． 05、 0． 10、 0． 15、 0． 20 mg／ mL的茶氨酸1GB／T 23 193—2008标准使用液有效期为一年5仪器5．1 高效液相色谱仪 (配有紫外检测器 )5． 2柱前衍生装置5． 3离心机5． 4振摇恒温水浴锅5． 5分析天平：感量 0． 000 1 g6测定步骤6． 1样品处理6． 1． 1按照 GB／ T 8303--2002 进行样品制备，按照 GB／ T 8302 进行取样6． 1． 2茶叶样品经磨碎混匀后，准确称取 0． 5 g(精确到 0． 000 1 g)，加水 100 mL，在 80℃ 振摇恒温水 浴锅中浸提 45 rain ，冷却后将浸提液离心、过滤，上清液混匀待用。
6． 1． 3将 C固相萃取柱经 5 mL甲醇活化，用 5 mL水平衡后，将试液过 c， s固相萃取柱进行净化，再 经0．45 pm的微孔滤膜过滤到棕色自动进样瓶中，待衍生用6． 1． 4衍生化 (选一 )6． 1． 4． 1样品自动柱前衍生程序 (参考 ) a)抽取样品提取液 5． 0 pL； b)冲洗进样针端口 5． 0 S； c)抽取衍生液 5． 0 pL； d)冲洗进样针端口5． 0 S；e) 混合 30 次 (混合时间为 2 min 左右 )；f)进样 (进样量为 10 pL) 6． 1． 4． 2样品手动柱前衍生准确吸取茶氨酸标准使用液 (或样品试液 )0． 5 mL于棕色自动进样瓶中混匀，临进样前加入0．5 mL OPA 衍生试剂，反应 2 min 后，立即取 10 pL进样6． 2测定6． 2． 1色谱条件色谱柱：C8色谱柱，5 pm ， 4． 6 minx 250 ram；或相当者 流动相： A： 20 mmol ／ L乙酸铵溶液；B： 20 mmol ／ L乙酸铵溶液：甲醇：乙腈一 1： 2： 2(体积比 )；VA ： VB 一 1： 1 流速：1．0 mL／ min。
柱温：40℃ 进样量： 10 pL检测波长：338 nm6． 2． 2标准工作曲线6． 2． 2． 1按 6． 1． 4． 1和 6 2． 1进行色谱分析，以峰面积一浓度作图，绘制标准曲线和回归方程标准样 品色谱图参见图 A． 16． 2． 2． 2按 6． 1． 4． 2和 6 2． 1进行色谱分析，以峰面积一浓度作图，绘制标准曲线和回归方程6． 2． 3试样测定 取已制备好的试样按色谱条件 (6． 2． 1)进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积，试样与标准溶2GB／ T 23193 —2008 液的衍生化处理至进样的时间应保持一致由色谱峰的峰面积可从标准曲线上求出相应的茶氨酸的浓度样品溶液中被测物的响应值均应在仪器测定的线性范围之内7分析结果的计算 茶叶中茶氨酸含量按式 (1)进行计算 ： x一丛 79t辫(1)X 1 UUU式中： x——样品中茶氨酸的含量，单位为克每千克(g／ kg)； c——样品浓度，单位为毫克每毫升(mg／ mL)； v——最终定容后样品的体积，单位为毫升 (mL)； m——样品的质量，单位为克 (g) 计算结果保留小数点后两位有效数字。
8精密度 在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％GB／ T 23193--2008附录 A (资料性附录 ) 茶氢酸标准样品液相色谱图图 A． 1 茶氨酸标准样品液相色谱图。