第八章生物抗氧化成分的测定第一节SOD(超氧化物歧化酶）活力和含量的测定一、SOD 活力的测定（邻苯三酚氧化法）1.原理利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O- 2 ，生成带色的中间产物反应开始后先变成黄绿色， 几分钟后转为黄色， 线性时间维持在 3~4min加入 SOD 酶液则抑制其氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光量酶活性单位采用1mL 反 应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位 2.仪器及试剂 （1）UV-260 自动紫外光分光光度计（或其他型号） （2）pH8.2、50mmol/L Tris - HCl 缓冲液50mL 50mmol/L Tris 加 20mL 50mmol/L HCl ，用水稀释至 100mL，调 pH 至 8.20 （3）50mmol/L KH2PO4-NaOH 缓冲液5mL0.2mol/L KH2PO4-NaOH 加 4.5mL0.2mol/L NaOH，用水稀释至 20mL，调 pH 至 7.8 （4）50mmol/L 邻苯三酚溶液用 10mmol/L HCl 配制 3.测定步骤 样品液制备：称取5.0g鲜样，加 10mL50mmol/L pH7.8 磷酸盐缓冲液，匀浆， 过滤，滤液置透析袋内， 于 5~7℃冰箱内动态透析6~8h （亦可每小时换透析液一次， 透析液为 pH7.8 磷酸盐缓冲液）。
若样品为溶液，可直接加pH7.8 磷酸盐缓冲液透 析 邻苯三酚自氧化速率的测定：在室温下（20~22℃），取 5mL 50mmol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲液，加 5μL 50mmol/L 邻苯三酚，摇匀，在325nm 下，1cm比色皿， 以 pH8.2 Tris-HCl 缓冲液为空白，立即测定吸光度，并每隔0.5min 测定一次，自氧 化速率控制在每分钟0.060~0.065（一般测定 4min，求得每分钟平均变化率） 样品中 SOD 测定：取 5mL 50mmol/L pH8.2 pH8.2 Tris-HCl 缓冲液，加待测样 品透析液 5~20μL ，加 5μL 50mmol/L 邻苯三酚，摇匀，立即同上测定 4.计算'VnV%50VVV)mL/u(SOD 010活力式中V0——自氧化速率吸光度； V1——样液速率吸光度； n——稀释倍数； V——反应液总体积（ mL）； V'——样液总体积（ mL）；二、SOD 活力的测定（化学发光法）1. 原理 黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤氧化生成尿酸的同时产生 O- 2 ·，O- 2 ·与化学发光剂鲁米诺（氨基苯二酰肼）反应生成激发态的中间物，当中间物返回基态时，以光辐射的能量产生发光现象，由于SOD 能清除 O- 2 ·, 所以抑制鲁米诺的化学发光，其抑制程度与酶活力大小有关。
2. 仪器及试剂 （1）生物化学发光仪 （2） 0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（含 0.1mmol/L EDTA-Na2， pH10.2） 称取 Na2CO3 3.68g，NaHCO3 1.28g，EDTA-Na2 37.22mg，用水溶解并稀释至1000mL，4℃储存 1~2 月 （3）0.05mol/L 磷酸盐缓冲液 （含 0.1mmol/L EDTA-Na2，pH7.8）称取 K2HPO4 7.970g，KH2PO4 0.579g，EDTA-Na2 37.22mg，用水溶解并稀释至1000mL，室温放 置 1 周 （4）0.1mmol/L 黄嘌呤（Xanthine） 黄嘌呤 3.8mg加 0.05mol/L 碳酸盐缓冲液 至 250mL，新鲜配制 （5）0.1mmol/L 鲁米诺（ Luminol） 鲁米诺 4.45mg加 0.05mol/L 碳酸盐缓冲 液至 250mL，新鲜配制黄嘌呤 -鲁米诺混合液（ 1+1），用前新鲜配制 （6）黄嘌呤氧化酶（ 0.1mg/mL） 黄嘌呤氧化酶（ 46mg/mL）22μL 加入 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液 10mL，用前新鲜配制（黄嘌呤氧化酶也可根据酶活性大小 配成适当浓度，以在发光仪空白300~400mV 的读数为宜）。
（7）超氧化物歧化酶标准品 3. 测定步骤 SOD 标准曲线的绘制：将标准品SOD 用 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液稀释成2，4， 6，8，10ng/mL，取不同浓度 SOD 液 10μL，加黄嘌呤氧化酶 10μL，再加鲁米诺 - 黄嘌呤混合液 980μL， 测定反应 1min 后 6s的发光值（mV） ， 空白对照用 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.8）10μL 代替，以空白对照的发光强度为100%，抑制发光程 度为纵坐标， SOD 浓度为横坐标，绘制标准曲线，求出抑制50%发光程度时 SOD 的浓度 C50（mg/mL） 样品测定：取血样10μL，加入到 0.5mL 水中，充分振摇使之溶血（1+50） 试剂添加量如表 2-8-1 所示表 2-8-1 样品测定时试剂添加量试剂 /μL 样品管空白管样品管空白管溶血液量0.05mol/L 磷酸盐缓冲液量10 10 黄嘌呤氧化酶量鲁米诺 -黄嘌呤混合液量10 980 10 980 按上表顺序加样，混匀后立即计时，测1min 后 6s 的发光值（ mV）或积分值 4. 计算 在 25℃条件下，抑制 50%发光程度时所需的SOD 浓度ρ50（ng/mL）为 1 个酶 活力单位。
100AAA% 010）发光抑制率（式中A0——空白发光值（ mV）； A1——样品发光值（ mV） 根据发光抑制率在标准曲线上查出样品的SOD 含量（ ng/mL））样品稀释倍数（实测样品发光抑制率样品稀释倍数）（标准品）含量（样品全血）活力（5000%50%mL/ngρSODmL/ngSODmL/uSOD 505. 讨论 （1）溶血液及黄嘌呤氧化酶的加样量可根据酶活性大小调整，但每次试验各组 加样量要一致，最终反应体积为1mL，可在加混合液前用水补齐2）SOD 活力测定方法灵敏度的高低取决于pH 和 O- 2 ·稳态浓度（即黄嘌呤氧化酶的量）三、SOD 活力和含量的测定（羟胺法）1. 原理O- 2 ·氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm处有最大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD 消除O- 2 ·后形成的亚硝酸盐减少2. 试剂 （1）1/15mol/L 磷酸盐缓冲液 pH 7.8 （2）10mmol/L盐酸羟胺 （3）7.5mmol/L 黄嘌呤 黄嘌呤 11.41mg，加水至 10mL （4） 0.023u/mL 黄嘌呤氧化酶取 25u/0.9mL 的黄嘌呤氧化酶8.4 μL 加 pH 7.8 磷酸盐缓冲液至 10mL。
（5）10g/L 甲萘胺； 3.3g/L 对氨基苯磺酸； 3g/L 磺基水杨酸 （6）SOD 标准品 3. 测定步骤 红细胞抽提液制备： 50μL 全血冲入 0.5mL 生理盐水， 2000r/min 离心 3min， 弃上清液，加冰冷的水0.2mL，混匀，加入 95%乙醇 0.1mL，振荡 30s，加入三氯甲 烷 0.1mL，置快速混合器抽提1min4000r/min 离心 3min，分层，上层为 SOD 抽提 液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测 组织匀浆的制备：剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎， 至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min 匀浆 10s，间歇 30s，反复进行三次， 制 成 10%组织匀浆（最好用超声波发生器处理30s），使线粒体振破，以中性红-詹钠 氏绿 B 染色证明线粒体已振破，以4000r/min 离心 5min，取上清液 20μL 待测 样品测定如表 2-8-2 所示表 2-8-2 羟胺法测定SOD 活力单位： mL 试剂测定管对照管1/15mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH 7.8）1.0 1.0 样品液A* 10mmol/L 盐酸羟胺0.1 0.1 7.5mmol/L 黄嘌呤0.1 0.1 0.023u/mL 黄嘌呤氧化酶0.1 0.1 双蒸水0.5 0.5 混匀， 37℃恒温水浴30min 3.3g/L 对氨基苯磺酸2.0 2.0 10g/L 甲萘胺2.0 2.0 A* 为所用样品的量，红细胞抽提液5~10μL；血清（或血浆）20μL；组织匀浆 5~10μL。
混匀 15min 后，倒入 1cm 比色杯，以蒸馏水调零，530nm 处比色测定吸光度SOD 标准抑制曲线：将SOD 标准品用磷酸盐缓冲液配制成750u/mL 的溶液， 再稀释到 50 倍，即 SOD 量为 15u/mL（1.15μg/mL），用本法测定不同量的SOD 标准液的百分抑制率， 以百分抑制率为纵坐标， 以 SOD 活力单位 u/min 为横坐标绘 制标准曲线100AAA%SOD 121）抑制率（式中 A1——对照管吸光度； A2——测定管吸光度 4. 计算 每 1mL 反应液 SOD 抑制率达 50%时所对应的 SOD 的酶量为一个活力单位n'VVA%50%100AAmL/uSOD 121）（）活力（式中A1——对照管吸光度； A2——测定管吸光度； V——反应液总量（ mL）； n——样品稀释倍数； V'——取液量（ mL） 也可用酶比活力即每管样品的百分抑制率从SOD 标准曲线查出相应的 SODu/mL，乘以稀释倍数（ 1mL/取样量） 若样品为组织匀浆，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为u/g 组织 或 u/mg 蛋白第二节、谷胱苷胺肽过氧化物酶活力测定1. 原理谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由 基反应的系统，防止体内自由基引起膜脂过氧化，其活力以催化GSH 氧化的反应 速度及单位时间内GSH 减少的量来表示， GSH 和 5，5'-二硫对硝基苯甲酸 （DTNB ） 反应在 GSH-Px 催化下可生成黄色的5-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子， 于 423nm 波长有 最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH 减少的量。
由于 GSH 能进行非酶 反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH 减少 2. 试剂 （1）叠氮钠磷酸缓冲液pH 7.0 NaN3 16.25mg，终浓度 2.5mmol/L 加 EDTA-Na27.44mg， 终浓度 0.2mmol/L， 加 Na2HPO4· 12H2O7.16mg， 终浓度 0.2mmol/L， 加 Na2PO4·2H2O3.12g，终浓度 0.2mmol/L，加水至 100mL，用少量 HCl 或 NaOH 调 pH 7.0，4℃保存 （2）1mmol/L 谷胱苷肽（还原型 GSH）溶液GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲 液至 100mL，临用前配制，冰冻保存1~2d （3）1.25~1.5mmol/L H2O2溶液取 30%H2O2 0.15~0.17mL，用水稀释至 100mL，作为贮备液， 4℃避光保存，临用前将贮备液用水稀释10 倍 （4）偏磷酸沉淀液偏磷酸 16.7g （先用水溶解） ， 加 EDTA-Na2 0.5g， 加 NaCl 280g，加水至 1000mL，滤纸过滤，室温保存 （5）0.32mol/L 磷酸氢二钠溶液。
（6）DTNB 显色液DTNB 40mg、柠檬酸三钠 1.0g，加水至 100mL，4℃避光 保存 1 个月 3. 测定步骤 血样稀释液：取血样 10μL 加入到 1mL水中，充分振摇，使之全部溶血（1+100）， 4h 内测定酶活力 （若当天来不及测定， 将肝素抗凝全血置 -20℃冻存，3d 内测定， 若4℃存放，28h 内必须测完测前取出样品室温自然解冻，按 1+100制备溶血液样 品） 测定表如 2-8-3 所示表2-8-3 。