抗原检测培训总结1.1抗体结构及同种型1.2选择合适的检测法1.3选择一抗1.4直接与间接检测法1.5选择二抗1.1抗体结构及同种型抗体，又名免疫球蛋白（lg），是一种由B细胞产生的大型Y形糖蛋白，可 在免疫防御中起主要作用抗体与病原体的特定分子（即抗原）发生特异性结合 抗体以一个或者多个Y形单体存在，每个Y形单体由4条多肽链组成（图1 ） 每个Y形单体包含两条相同的重链（H ）和两条相同的轻链（L ），重链和轻链 的序列和长度不同Y形单体的顶部包含可变区（V）也称抗原结合片段（F（ab）） 区该区可与给定抗原上的表位特异性紧密结合抗体的基本结构包含恒定区（C ）和可结晶片段（Fc ）区这一区域对抗体的免 疫应答功能非常重要此外，将荧光染料和酶经共价键连接到抗体的Fc部位， 可实现实验的可视化由免疫球蛋白重链（H ）和轻链（L ）组成的可变区（V ）抗体的基本结构由恒 定区（C ）组成根据多肽序列的微小差异，抗体的轻链都可分为kappa （k）型或lambda （入）型 重链结构决定了各个抗体的总类哺乳动物体内的抗体分为5种同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE如图2所 示，各个同种型都有其独特的结构。
这些同种型因Y形结构的数量和重链种类 而异它们的生物学特性、功能区域以及结合不同抗原的能力有所不同igG3igDNNigEcIgAheavy chain QigMlgGL2+4ll^til cfialn korlqntigren biddingOlotogicol QctivltYit图2.抗体结构及同种型1.2选择合适的检测法研目标数究内用途样本类型应用据类型容l-*-!曰 定量ICC测定亚细胞定位固定细胞定 性及半 曰 定量浓度WB测定蛋白相对含量细胞及组织裂解液半曰 定量ELISA准确定量蛋白含量血清、血浆活或固定 细胞或组织定性及定量相互作用ELISA检杳分子相互作用血清、血浆、细胞或组织定性及定量表达FCM或 FACS分析细胞属性，例如大小、细胞表面标志物的表达固定或活细胞定量识ELISP识别分泌目标分析物的具活细胞定Cone.=浓度；IHC =免疫组织化学；ICC =免疫细胞化学；ELISA =酶联免疫吸附 试验；FACS =荧光活化细胞分选技术；FCM =流式细胞术；ELISPOT =酶联免疫 斑点法；WB = western blot1.3选择一抗选择一抗时，需要考虑以下因素：克隆性选择抗体时，需考虑的重要因素之一是克隆性。
克隆性取决于抗体来自亲代克隆 的不同B细胞（多克隆抗体）还是相同B细胞（单克隆抗体）这些抗体有各 自的优点和局限性多克隆抗体是一种异型抗体混合物，其中的抗体来源于多个B细胞的免疫应答 过程，并且每种抗体均可识别同一抗原的不同表位由于多克隆抗体可检测蛋白 上的一系列表位，因此与单克隆抗体相比，它们批间变异的风险更高但是，由 于多克隆抗体对单一表位不存在特异性，因此与单克隆抗体相比，它们对抗原微 小变化的宽容性更强单克隆抗体由单个B细胞亲本克隆产生，因此，只能识别单个抗原的一个表位 单克隆抗体对靶向的抗原表位具有高度特异性，非特异性交叉反应性低，批间变 异很小下面的视频通过靶向组蛋白修饰的抗体示例，阐述了多克隆抗体与单克隆抗体之 间的差异单克隆抗体通常使用免疫动物的B细胞制备，通过融合永生细胞系形成分泌所 需抗体克隆的杂交瘤细胞该杂交瘤技术可大量生产一致性高、特异性强、灵敏 度高的单克隆抗体然而，随着时间的推移，杂交瘤细胞系会出现遗传漂变，导 致抗体出现微小差异目前，人们对靶向高难度靶点（即毒素、核苷酸和膜结合蛋白）的抗体的需求日 益增加，这些抗体并不都能用这种in vivo模式生产出来重组抗体在in vitro环境中将免疫特异性重链和轻链抗体基因克隆到高产表达载 体中产生。
接下来，这些载体会被引入表达宿主（例如细菌、酵母或哺乳动物） 中，用于生产重组单克隆抗体与传统的单克隆和多克隆抗体相比，重组抗体具有多个优点：•批间差异非常低，因此一致性和可重复性高•经过抗体工程，灵敏度及特异性增加•易于扩展•无动物高通量生产种属理论上，待测样本的种属应该与抗体的种属不同对于western blot等使用不 含内源性免疫球蛋白（IgG ）的细胞裂解液的应用，或者使用直标一抗的实验， 您不需要担心这个问题关于非模式生物体的说明: 如果您研究的是一个非模式生物样本，您可能需要选用一种未在该种属中检测过 的抗体多数情况下，蛋白质在几类种属间足够保守，因此，该蛋白可被未经该 种属验证的抗体识别复制抗体的免疫原序列并将它与您想检测种属的蛋白序列进行比对比对得分大 于85%，表示抗体可能会发生交叉反应但即使比对得分大于85%，我们也无 法保证抗体性能您需要设置多个对照组，确保抗体作用符合预期关于免疫原的考虑抗体由免疫宿主动物产生，且同样是免疫原性物质免疫原可以是全长蛋白、蛋 白片段、多肽、整个生物体（例如细菌）或细胞供应商提供的数据表通常会提 及免疫原抗体的免疫原会决定蛋白抗体的结合区域。
观看下面的短视频，了解为何应该在 挑选抗体前考虑免疫原无载体抗体通常情况下，抗体储存在含有几种关键载体（牛血清白蛋白（BSA）、甘油和叠氮 化钠）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中尽管BSA和叠氮化物是维持抗体稳定 性和防止抗体污染的必要成分，旦这些成分也会妨碍抗体与荧光染料、金属和酶 的有效偶联BSA与一抗竞争结合标记物，会大大降低偶联效率抗体溶液中存在的叠氮化钠 可能对细胞有毒害作用，限制了抗体在细胞培养中的使用因此，如果您想偶联 —抗或将它用于活细胞染色我们推荐您选用无载体形式的抗体例如无BSA抗 体及无叠氮化钠抗体—抗选择检查表•检查一抗的克隆性、应用适用性、宿主种属及种属反应性这些都可以在供 应商数据表中找到•查看供应商提供的图片和资料一一数据看上去是否可靠？•浏览用户评价及近期引用抗体的论文一一供应商数据表应该也会提供这些资料，并帮助您了解抗体性能1.4直接与间接检测法对于与目标抗原结合的一抗，可以用直接检测法，也可以用间接检测法检测直接检测法将一抗直接与标记物进行偶联使用间接检测法时，一抗需要与靶向—抗宿主种属的标记二抗结合间接检测法也可放大和增加信号强度选用直接直接检测法间接检测法直接检测法 间接检测法直接检测法间接检测法E寸 耗时更短，只需一步标记步使用偶联二抗，增加了操作步骤，间骤。
耗时更长复实验方案步骤更少，操作简必须选择合适的二抗（或可用于多杂性单重检测的抗体组合），结果复杂灵 由于缺少二抗来放大信号，可能有多个二抗结合到一抗上，使敏度灵敏度似乎弱于间接检测法得信号放大景to非特异性结合减少带有内源性免疫球蛋白的样本可能 产生高背景如果您想了解有关直接检测法与间接检测法在多种应用（包括细胞成像及流 式细胞术）中优势与局限性的更多信息，可以观看该网络研讨会1.5选择二抗如果您使用的不是直接偶联一抗，那么您将需要选择合适的二抗二抗应可靶向一抗的种属和同种型，并通过与一抗的多个位点结合来检测一抗 为您的实验选择二抗时，您需要考虑以下几个方面宿主种属二抗特异性地结合在生成一抗的宿主种属的IgG上例如，如果您的一抗来自 兔，那么您需要选择在除兔以外的其他宿主种属中培养的兔二抗（例如驴抗兔二 抗）抗体种类/亚类二抗必须抗一抗的同种型多克隆一抗通常来源于兔、山羊、绵羊或驴，且通常 是IgG同种型因此，二抗通常是抗IgG H&L （重链&轻链）抗体单克隆一抗通常来源于小鼠、兔和大鼠例如，若单克隆一抗是小鼠lgG1，那 么您需要使用抗小鼠IgG或特异性较弱的抗小鼠IgG的F（ab）片段。
不同应用中偶联物的选择为了使目标蛋白可视化，二抗需偶联荧光染料/蛋白、酶或生物素•荧光标签会在特定波长的光激发下发光有多种激发和发光性质不同的荧光标 签可用•酶标记，例如可与合适底物结合产生有色沉淀的辣根过氧化物酶（HRP ）和碱 性磷酸酶（AP）•生物素标记的抗体应用于亲和素-生物素-酶或荧光复合物（通常缩写为ABC 试剂）或者亲和素或链霉亲和素结合酶或荧光染料检测法时，可对信号的放大起 有效作用偶联物的选择取决于实验应用对于ELISA或western blot等应用，酶联二抗 最受欢迎；但是，对于流式细胞术或免疫荧光法，研究人员更倾向于选择偶联荧 光蛋白或Alexa Fluor®等荧光染料的二抗下面推荐一些适用于您可能使用的几种主要应用的二抗二抗酶荧光染料IHCHRP、HRP聚合物、生物素（与酶或 荧光染料偶联的亲和素/链霉亲和素）AlexaFluor®, Cy® 染料,FITC,PEICC-Alexa Fluor®,Cy® 染料,FITC, PEWesternblotHRP, APIRDye®, Alexa 680,Alexa 790ELISA orELISPOTHRP、生物素（与酶或荧光染料偶联 的亲和素/链霉亲和素）-流式细胞术或FACS-Alexa Fluor®,Cy® 染料，FITC, PEIHC =免疫组织化学；ICC =免疫细胞化学；FACS =荧光活化细胞分选技术；HRP=辣根过氧化物酶；AP =碱性磷酸酶预吸附二抗同时使用多种一抗及其相应的二抗进行多色实验时,预吸附二抗是消除种属反应 性的理想选择。
预吸附（又名交叉吸附）是为提高抗体特异性而引入的额外纯化 步骤,其可降低二抗与细胞和组织样本中内源性免疫球蛋白发生交叉反应的风险F（ab）片段抗体 F（ab）和（Fab'）2片段二抗可避免抗体的Fc部分与细胞（例如巨噬细胞、树突 细胞、中性粒细胞、NK细胞和B细胞）上的Fc受体之间发生非特异性结合， 而且这种抗体尺寸较小，能够更有效地渗入组织。