液相色谱 串联质谱测定面条和米粉中的硫脲【摘要】建立了米面制品中硫脲的液相色谱 串联质谱（LCMS/MS）测定方法实验优化了 样品提取方法、液相色谱条件和质谱参数样品用80%乙醇超声波提取，离子交换色谱分 离，色谱柱为NUCLEOSILIOO 5SA阳离子交换柱，流动相为乙腈（1%乙酸0.2%乙酸铵） 水溶液（30 : 70）,流速0.5mL/min采用电喷雾质谱正离子模式电离，多反应选择离子检测， 检测离子对为m/z77/60和m/z77/43，其中m/z77/60为定量离子对结果表明：本方法简便 快速、准确可靠，相对标准偏差＜4.0%;回收率为83%〜90%;检出限为0.5mg/kg淀量下限为 5mg/kg关键词】硫脲，液相色谱，串联质谱，面条，米粉1引言硫脲（thiourea）又称硫代尿素，是一种纺织品的化学漂白剂，曾一度作为防腐剂，广泛用 于各类需要漂白、保鲜防腐的食品向食品中加入硫脲可阻止褐变，表观光亮，略带半透明 硫脲被人体摄入后危害健康，抑制甲状腺和造血器官的机能，引起中枢神经麻痹及呼吸和心 脏功能降低等，甚至导致死亡由于硫脲毒性大，我国已不允许其作为食品添加剂使用近 年有报道，我国东南沿海曾有用硫脲作为面条的增白剂、增筋剂，而目前我国尚无食品中硫 脲测定的相关标准方法。
在当今食品安全问题严峻的状况下，迫切需要尽快建立其检测方法目前，空气、水、土壤和生物等材料中硫脲的检测方法已有报道［1〜4］，通常采用高效 液相色谱法;Raffaelli等⑸报道了用大气压化学电离质谱法测定废水中的硫脲但至今未见 食品中硫脲检测的相关报道由于食品基质复杂，采用液相色谱法干扰很大，且灵敏度较低 本研究采用液相色谱串联质谱（LC MS/MS）法检测面条和米粉中的硫脲，考察了样品的提 取方法，优化了色谱条件和质谱条件本方法简便快速、准确可靠，检出限为0.5mg/kg;定 量下限为5mg/kg，适用于面条、米粉等米面制品中硫脲的测定2实验部分2.1仪器与试剂Agilentl200LC/6410BMS液相色谱/串联四级杆质谱 联用仪;AS3120超声波发生器 （AutoScience 公司），功率 250W，频率 33kHz硫脲（Thiourea，纯度三98.0%）；硫脲标准溶液的配制：以水为溶剂配制质量浓度为 1000mg/L的标准溶液，经0.22 m m滤膜过滤后作为储备液使用时用水逐级稀释至所需浓 度;乙腈和甲醇（HPLC级）；乙酸、乙酸胺、乙醇等（分析纯，广州化学试剂厂）；实验用水为 二次蒸馏水。
2.2样品预处理将样品用粉碎机粉碎，取2.0g粉碎后的样品置于具塞三角瓶中，加入20.0mL80%乙醇 溶液，盖上盖，超声波振荡提取15min，将超声波提取后的样品混合物全部转移至离心管中， 以3500r/min离心15min移取上清液lO.OmL至50mL烧杯中，在68°C水浴上浓缩至约ImL 然后转移至5mL刻度试管中，用水洗涤烧杯多次，洗涤液合并入l.OmL刻度的梨形瓶中， 在50C下吹氮浓缩定容至l.OmL2.3 LC MS/MS 测定2.3.1HPLC 条件色谱柱：NUCLEOSILlOO 5SA 阳离子交换柱(250mmX4.6mm, 5p m);流动相：乙腈(1%乙酸0.2%乙酸铵)水溶液(30：70,V/V),流速0.5mL/min进样量5.0 p L2.3.2质谱条件电喷雾(ESI)正离子电离模式干燥气(N2)温度350C;雾化气(N2)压力 276kPa汗燥气(N2)流量9.00L/min;电喷雾电压4000V;检测离子对为m/z77/60和m/z77/43, 其中m/z77/60为定量离子对；采集时间200ms;碎裂电压80V;碰撞能量36V(m/z77/60)和 48V(m/z77/43)。
2.3.3测定方法取样品溶液和标准溶液各5.0p L注入液相色谱串联四级杆质谱仪进行 分析，以其标准溶液峰的保留时间和质谱检测离子对m/z77/60和m/z77/43为依据进行定性 分析，以定量离子对m/z77/60的峰面积计算样品中硫脲的含量3 结果与讨论3.1液相色谱条件的优化考察了 C18柱、C8柱、NH2键合相柱及阳离子交换柱对硫脲分离的影响结果表明： 采用C18色谱柱时，当流动相为乙腈 水体系时[4],硫脲几乎无保留;当乙腈比例降低至10% 时，硫脲仅有少许保留，保留时间为2.7min(色谱柱规格为250mm X 4.6mm，流速为 1.0mL/min，下同);当在流动相中添加庚烷磺酸盐离子对试剂时，硫脲的保留时间并无明显 增加采用C8色谱柱时，当流动相为乙腈 庚烷磺酸盐体系时，随着乙腈比例从65%，40% 至5%逐渐减少，硫脲的保留时间从2.9min, 3.0min至3.3min逐步增加，但保留时间仍太短 采用NH2键合相色谱柱时，当流动相为乙腈 水体系时，随着乙腈比例依次从70%, 80%, 90%增加到100%，硫脲的保留时间也从3.47min, 3.55min, 3.65min延长到3.79min,但增 加幅度不大，保留时间较短，且峰形较宽。
采用阳离子交换色谱柱时，当流动相为乙腈，磷 酸盐缓冲液和乙腈，乙酸铵缓冲液体系时，乙腈比例为30%时，硫脲的保留时间为3.4min, 峰形较理想；随着乙腈比例的减少，硫脲的保留时间虽逐步增加，但增加幅度不大且色谱峰 展宽严重；改变缓冲液的浓度和pH值，硫脲的保留时间并无明显改变以上实验表明，硫脲由于相对分子质量很小，极性较强，在各类型的色谱柱上保留时间 均较小，用液相色谱紫外检测法测定实际样品时受到的干扰较严重因此采用液相色谱 串 联质谱法测定考虑到质谱法测定不能使用离子对试剂、磷酸盐缓冲液作流动相,并综合考 虑保留时间和色谱峰形，故选择阳离子交换色谱柱和乙腈，乙酸铵缓冲液体系经实验本方 法最终选择的色谱柱为NUCLEOSIL100 5SA阳离子交换柱(250mmX4.6mm, 5p m),流动 相为乙腈(1%乙酸0.2%乙酸铵)水溶液(30： 70, V/V),流速0.5mL/min此条件下硫脲的 保留时间为6.7min，峰形较好3.2质谱参数的优化用 0.5mg/L 硫脲标准溶液，采用 ESI 正离子模式进行一级质谱扫描，得到硫脲准分子离 子峰m/z77，即［M H］以m/z77为母离子作二级质谱，得到硫脲碎片离子峰m/z60和43, 即［M H-NH3］和［M H-H2S］。
选择m/z77/60和m/z77/43离子对进行MRM模式检测，并对 各质谱参数进行优化优化后的质谱条件见2.3.2节硫脲的ESI二级质谱图见图1优化 后的硫脲标准溶液的HPLC MS/MS色谱图见图23.3样品前处理条件的优化3.3.1 不同提取剂对硫脲提取效果的影响比较了用氯仿、甲醇、乙醇、乙腈和水作提取 剂的提取效果在2.0g粉碎后的面条样品中加入11.6mg/L硫脲标准溶液1.0mL，待溶液完 全被样品吸收后，再分别用氯仿、甲醇、乙醇、乙腈和水进行超声波振荡提取按前述 LCMS/MS方法测定硫脲的提取效率结果表明，氯仿几乎无法提取出硫脲，甲醇、乙醇、 乙腈和水的提取效率分别为 86.5%， 70.0%， 67.1%和 88.3%，可见以水作提取剂的效率最高 但用水提取时，样品中的淀粉及其它添加剂也会被提取出来，导致提取液混浊且粘稠，后续 处理很麻烦；而用甲醇和乙醇提取虽然效率略低，但提取液较干净，处理过程简便快捷因 此结合二者的优点，考虑用甲醇或乙醇和水的混合溶剂进行提取分别考察了甲醇比例为 20%〜80%时的提取效果和乙醇比例为20%〜80%时的提取效果，结果见表1由表1可见， 80%乙醇 水混合溶剂的提取效果最佳。
表1不同比例的醇和水对硫脲的提取效果3.3.2提取时间对硫脲提取效果的影响考察了超声波提取10，15, 20, 25和30min时的 提取效果，其回收率分别为 87.3%， 88.1%， 86.3%， 85.6%和 85.8%可见超声波提取时间 对硫脲的提取效果影响不明显，超声 10min 后提取率已基本稳定本实验选择超声波提取 时间为15m in,可满足分析要求综合以上结果，确定样品的最佳前处理条件为2.2节所述由于采用MRM方式测定， 避免了样品基体杂质的干扰，故样品提取后无需净化即可直接上机分析，简便快速，回收率 较高3.4线性范围、线性方程与检出限取硫脲标准储备液逐级稀释成 0.501， 1.002， 2.004， 5.01， 10.02 和 20.04mg/L 的系列 标准溶液，进行LC MS/MS分析以峰面积(A)和质量浓度(p，mg/L)作定量工作曲线，线 性方程为A=1209p -30.91，相关系数为0.9999，在0.5〜20mg/L浓度范围内线性关系良好 当样品中的硫脲超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数以信噪比 S/N=3 确定样 品的检出限为0.5mg/kg，采用标准添加法进行实测确定硫脲的定量下限为5.0mg/kg，可满 足米面制品中对硫脲的检测要求。
3.5 回收率和精密度取不含硫脲的面条和米粉样品各3组，分别加入5.01，10.02和50.10mg/kg硫脲标准溶 液，待完全被样品吸收后，按实验方法测定硫脲的回收率，每组样品平行测定 6次，结果见 表2由表2可见，面条样品中硫脲在添加水平5〜50mg/kg，其回收率为83%〜89%,相对 标准偏差为0.8%〜4.0%;米粉样品中硫脲在添加水平5〜50mg/kg，其回收率为88%〜90%, 相对标准偏差为1.7%〜3.3%面条空白及加标样品的HPLC MS/MS总离子流色谱图见图 3a和bo本方法回收率较难达到90%以上，可能是基质表2标准加入样品中硫脲的回收率和 相对标准偏差。