第第 七七 章章 植植 物物 胚胚 胎胎 培培 养养 制作人制作人制作人制作人: : 董雯董雯董雯董雯生物技术教研室生物技术教研室生物技术教研室生物技术教研室 7.1 胚胎培养的内容及意义胚胎培养的内容及意义7.1.1 7.1.1 胚胎培养意义胚胎培养意义 离体胚胎培养可以克服种、属间受精障碍，打破种子休眠，缩短育种周期，克服种子生活力低下和自然不育等，对于植物界物种的进化具有极其重要的意义 （一）（一）植物受精不育的机理植物受精不育的机理（二）（二）打破种子休眠打破种子休眠（三）（三）缩短育种周期缩短育种周期（四）（四）克服种子生活力低下提高萌发率克服种子生活力低下提高萌发率（五）（五）克服种子的自然不育性克服种子的自然不育性（六）（六）种子生活力的测定种子生活力的测定内容内容 （一）（一） 植物受精不育的机理植物受精不育的机理（（1 1））自自然然界界两两种种隔隔离离机机制制植物界由于长期自然选择的结果，产生两种隔离机制：® 拒绝异种受精，杂交不亲和现象在种，属以上的植物杂交中，常常可以见到，由于杂交不亲和性的存在，才能保持物种的遗传稳定性。
® 拒绝自花受精，由于自交不亲和现象的存在，才能确保物种具有强生活力 （（2）植物受精不育障碍的表现形式）植物受精不育障碍的表现形式 ① 花粉在柱头上不萌发，或萌发后花粉管不能伸入花柱或生长缓慢，使配子丧失受精机会这类不育障碍，可采用试管受精的方法克服 ② 花粉管生长正常，有配子融合但由于胚败育而引起的受精不育胚败育的原因：可能是胚乳早期败育或胚胎发育和珠心组织发育不同步 ③ 有配子融合，但缺乏同源染色体，染色体配对上出现障碍培养时可以兼用秋水仙素染色体加倍，可等到可育植株 （二）（二） 打破种子休眠打破种子休眠 种子休眠的原因很多，但是能利用幼胚培养打破种子休眠的情况有如下两种：（1）种胚发育不全（2）抑制物质抑制种胚发芽 （三）（三） 缩短育种周期缩短育种周期 柑橘（芸香科）为多胚植物，除正常有性胚外，还可以从珠心组织发生多个不定胚常规杂交育种中，不定胚干扰了对有性胚的识别再者，不定胚的生长势强，具有很强的竞争力，因而影响柑橘杂交育种的结果利用胚离体培养的方法，可以使合子胚正常发育成植株 （四）（四） 克服种子生活力低下提高萌发率克服种子生活力低下提高萌发率 杂交育种中以某些种的早熟种为母本而获得的杂种，种子生活力低下，甚至经过冷藏处理也不能萌发。
例：“京早3号”早熟桃（杂交种）熟性比一般早熟桃提前15－20d在2－5℃正常冷处理，60d后播种，出苗极不整齐在2－5℃预冷后取胚接种培养，5－7d后萌发，20－30d长成4－6cm高的苗（覃兰英，1974） （五）（五） 克服种子的自然不育性克服种子的自然不育性 长期营养繁殖的植物，具有形成种子的能力，但它们的种子常是无生活力的胚胎培养有可能促进这类种子的萌发和形成幼苗 （六）（六） 种子生活力的测定种子生活力的测定 测定休眠后的种子生活力，应用一般的种子萌发试验需很长时间，特别是木本植物需要层积处理打破休眠 Tukey（1944）发现未经层积处理的和经层积处理的种胚，离体培养条件下萌发速率一致因此，这一方法用于快速测定种子生活力已被广泛采用 总 结胚胎培养的意义1、克服杂种胚的败育，获得稀有杂种2、获得单倍体和多倍体植株3、打破种子休眠，促进胚萌发4、快速繁殖良种，缩短育种周期5、克服种子生活力低下和自然不育性，提高种子发芽率6、种子活力的快速测定7、种质资源的搜集和保存8、研究胚胎发育的过程和控制机制 7.1.2 胚胎培养的内容和概念 胚胎培养是植物组织培养的一个主要领域。
植物胚胎培养是指对植物的胚（种胚）及胚器官（如子房、胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术 主 要 内 容(一) 胚培养(二) 胚珠培养(三) 胚乳培养 (四) 试管受精 (一) 胚培养1）成熟胚培养：指子叶已形成的种胚仅提供一定温度、湿度就可以发芽长成植物体如种子发芽2）幼胚培养：胚龄处于原胚期、球型期、心型期、早鱼雷期的幼胚的培养这几个时期幼胚从生理至形态均未成熟，提供一定温度和湿度均不能发芽在远缘杂交育种上幼胚培养有极大的利用价值 (二) 胚珠培养1）未受精的胚珠的培养，目的是为试管受精提供雌配子体；也可诱发大孢子发育成单倍体植株2）受精后胚珠的培养，胚珠内胚的发育处于早期阶段，从两个细胞的原胚开始至球形胚阶段如兰科的成熟胚很小，采用胚珠培养较易成功，也同样能达到使胚发育成幼苗的目的 柱头柱头花柱花柱子房子房花梗花梗花托花托花组成花组成胚囊胚囊卵细胞卵细胞株心株心珠珠 孔孔反足细胞反足细胞珠珠 被被胚 珠胚 珠极核极核 株柄株柄 (三)胚乳培养 指处于细胞期胚乳的离体培养四)试管受精 指培养未受精的胚珠并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有生活力的种子。
7. 2 胚 培 养 植物在受精后，受精卵形成合子，随即进行第一次分裂，进而形成分生组织和幼胚，再发育成成熟胚在这个过程，胚靠消耗胚乳的营养而发育，同时胚处在胚囊环境中，可吸收氨基酸、维生素等营养离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，一般可分为成熟胚和幼胚培养 7.2.1 离体胚培养的方法（一）成熟胚 将受精（传粉）后的果实或种子（带种皮）用药剂进行表面灭菌，然后在无菌操作台上，剥出种胚接种于预先配制好的培养基上，使裸露的胚，在人工控制的条件下，发育成一棵完整的植物体 种子植物离体的成熟胚，在只含种子植物离体的成熟胚，在只含大量元素的无机盐和糖的培养基上大量元素的无机盐和糖的培养基上就可萌发生长就可萌发生长对成熟胚的培养而对成熟胚的培养而言，大多是利用这种技术来研究胚言，大多是利用这种技术来研究胚发育过程的形态建成、生长物质的发育过程的形态建成、生长物质的作用、各部分的相互关系，以及营作用、各部分的相互关系，以及营养要求等生理问题养要求等生理问题 （二）幼胚 发育早期的幼胚，由于胚胎发育要求更为完全的人工合成培养基，而且剥离技术要求很高，用成熟胚的培养方法很难成功，可以采用胚珠预培养的方法。
具体做法：将授粉后的子房剥出用药剂进行表面消毒，在无菌条件下切取胚珠进行预培养培养一定时间后，再将胚从胚珠中剥出，接着培养裸露的胚，使其在人工控制的条件下，发育成一棵完整的植物体 从离体胚到完整的植株，其发育途径有3条：1、正常胚胎发育途径2、脱分化形成愈伤组织3、早熟萌发产生畸形苗 7.2.2 胚龄与胚性发育的关系 不同发育时期的幼胚，离体培养成功率差异很大一般胚龄越大成功率越高，相反胚龄越小成功率越低处于原胚期的幼胚即使采用胚珠预培养的方法，也仅有少数植物种能够成功，如烟草、矮牵牛、朱顶红、棉花离体培养中幼胚培养的成功率主要取决于培养基的组成 胚龄 胚长度（μm） 营养需要（培养基营养） ®早球形胚 20－60 小于40μm长的胚尚不清楚 ®后球形胚 61－80 大量、微量、VB1、VB6、烟酸、糖2％、IAAO.1mg/L十KTO．001 mg／L ®心形胚 81—450 大量、微量、VB1、VB6、烟酸、糖2％ ®鱼雷胚 451－700 Ca（NO3）2480、KNO363、KCl42、MgSo463 KH2Po442、VB1、VB6、烟酸、糖2％ ®成熟胚（手杖胚）最大极限（700μm） Ca（NO3）2480、KNO363、KCl42、MgSo463、糖 2％例：Raghavan(1966)对不同发育时期的荠菜胚进行离体培养，了解荠菜胚发育的营养需要（表7－l）。
结果表明： （1）培养已分化的成熟胚，只需提供简单的营养元素即在含有大量元素无机盐和糖的培养基上，成熟胚就能萌发成一棵正常植物体 （2）培养未分化的幼胚，要求完全异养的条件对培养基要求高除要求提供大量和微量无机盐混合物外，还需提供有机物（维生素类）和植物激素 （3）早球胚期（20－4μm）的幼胚更难培养因为它们的营养需要尚不清楚 适宜胚胎培养的基本培养基和附加物¨基本培养基： Tukey（1934） Rangaswamy（1961） Randilph＆Cox（1943） Norstog（1963） Rijven（1952） White（1963） NitsCh（1953） Rappaport（1954） ¨ 附加物：Ø 维生素类：除常用的VB1、VB6、烟酸外，还有生物素、泛酸钙、VCØ氨基酸类：除甘氨酸外，还有谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸胺、天冬酰胺Ø核酸及其水解物：腺嘌呤（ADE）、胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘧啶、水解酪蛋 白，酵母提取物、椰乳、麦芽提取物等Ø植物激素：除生长素、细胞分裂素外，还有赤霉素 7.2.3 离体胚培养的技术关键 有关受精后的幼胚培养，除考虑胚龄之外，还应重视在离体条件下幼胚分化和发育的环境条件、渗透压和酸碱度条件等。
（一） 培养基渗透压对胚性发育的作用 培养基渗透压，对幼胚发育的重要性，与其他器官培养一样因为幼胚在自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳，具有较高的渗透压，人工培养基中要创造高渗透压的条件，渗透压的调节主要依赖于糖，糖在胚培养中具有三个方面作用：调节渗透压、作为碳源和能源和防止幼胚的早熟萌发 （1）幼胚早熟萌发的概念 在含有无机盐、有机物和蔗糖的培养基上，离体培养的幼胚越过正常胚胎发育阶段，在未达到生理和形态成熟的情况下，萌发长成幼苗，称早熟萌发早熟萌发成的幼苗往往畸形、细弱，甚至不能存活所以幼胚培养中，防止早熟萌发是非常重要的 （2）防止幼胚早熟萌发的方法 ①提高培养基渗透压胚龄越小要求的渗透压（糖浓度）越高，高糖浓度控制幼胚早熟萌发的效果早已被证实下述实例阐明不同胚龄对糖浓度的要求②提高无机盐浓度提高无机盐浓度也是为了提高培养基渗透压可加入适量的NaCl以提高渗透压，浓度一般为0．2％－0．4％，超过0．8％对胚有毒害作用 ③加人甘露醇提高渗透压甘露醇的浓度为1．l％－5．5％，以部分地代替蔗糖，使幼胚在等渗条件下继续胚性发育 （二） 培养基酸碱度对胚性发育的影响 培养基酸碱度对胚性发育也是非常重要的。
通常胚培养所用pH值的范围为因植物种类不同而有所差异 如：® 荠菜： 5.4－7.5 桃：5.8® 曼陀罗：5.0一8.1 水稻：5.0® 番茄： 6.50 大麦：4.9 (三) 环境条件对胚性发育的影响 1）光照条件： 由于胚在胚珠内发育是不见光的一般认为在黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜光照对胚胎发育有轻微抑制作用，离体培养条件下，幼胚正常胚性发育对光的要求，还应根据植物种类来决定 光照可以促进某些植物的胚转绿，利于胚芽生长，而黑暗利于胚根生长因此以光暗交替培养较为有利 ®棉花：胚先在黑暗中培养，然后转人光照下培养，子叶的叶绿素生成很慢；而转人弱光下培养的幼胚，子叶很容易产生叶绿素®芥菜：胚培养每天以 12 h光照比全暗条件好 2）温度条件： 因植物种类而异，幼胚培养与其他器官培养无多大区别对于大多数植物的胚来说，在25～30℃为宜，但是，早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长，而马铃薯胚以20℃为好 7.3 胚乳培养 7.3.1 胚乳离体培养的意义 被子植物的胚乳是双受精的产物，是由精细胞和二个极核融合而成，故胚乳细胞为三套染色体。
但是由于胚囊类型不同，参加融合的极核数目不同，胚乳的倍性亦不同如待宵草型胶囊只有一个极核与精细胞融合，胚乳核为2n；贝母型胚囊两个极核，其中一个是n，另一个是3n，与精细胞融合后胚乳核为5n；椒草型胚囊中有8个极核，与精细胞融合后胚乳核为9n 胚胚囊囊 至今，尚未见到胚乳细胞在自然状态下器官发生的报道最早报道由玉米胚乳离体培养得到可连续生长的愈伤组织（Lampe等，1933）后来在巴婆(番荔枝科)、黄瓜（葫芦科）、黑麦草（禾本科）、蓖麻（大戟科）、桑寄生科、檀香科等植物相继报道由胚乳培养得到愈伤组织最先报道由胚乳组织培养而器官发生的是柏形外果（檀香科）的芽分化（ Johri等，1965）；通过离体胚乳培养第一个得到三倍体的植物是罗氏核实木（大戟科）（Johri，1978）（表7－2，表7－3） 当前胚乳离体培养的研究进展：1)仅能形成愈伤组织的有：巴婆、黑麦草、黄瓜、檀香、小麦、沙针、美洲懈寄生、澳洲根寄生2）达到器官分化水平的有：玉米、蓖麻、巴豆、麻疯树、变叶木、黑种草、葡萄荷叶芹、桃、柏形外果、印度五蕊寄生、白花寄生、酸细檀、怒江钝果寄生、楔叶钝果寄生3）能形成完整植株的有：罗氏核实木、大麦、水稻、苹果、抽、橙、马铃薯、桃、荷叶芹。
目前为止，约有30种被子植物的胚乳培养，达到不同程度的细胞分裂和器官分化说明胚乳组织也具有发育成植株的潜在能力在应用上胚乳培养为植物界创造新种提供了一条可行途径 7.3.2 胚乳培养的方法 取有胚乳的果实或种子，进行表面灭菌，然后在无菌条件下剥离胚乳接种培养培养时有带胚培养和不带胚培养两种方式 带胚培养胚乳组织容易成功，不带胚培养胚乳组织成功率低 取授粉4～8天后的幼果，常规消毒后，在无菌条件下切开果实，取出种子，小心分离出胚乳接种在培养基上，可用MS、White等，加入2，4-D或NAA0.5～2.0mg/l，BA0.1～1.0 mg/l在25～27℃和黑暗条件或散射光下培养,约6～10天胚乳开始膨大,再培养形成愈伤组织这时应转到分化培养基上培养,分化培养基可加入0.5～3.0 mg/l的BA及少量的NAA待愈伤组织长出芽后,切下不定芽,插入生根培养基中，光下培养10～15天,切口处可长出白色的不定根 7.3.3 胚乳培养的技术关键(一) 胚乳发育时期的影响 双受精后的胚乳核，先分裂形成游离核把这一时期的胚乳称为“游离核期”继续发育后形成细胞壁，即形成许多小的细胞。
这一时期称为“胚乳细胞期”，见图7－1 游离胚乳核 受精卵一 受精后12小时的状态 二 受精后36小时的状态 球状胚体 以“游离核期”的胚乳为材料离体培养很难成功；而“细胞期”的胚乳为材料离体培养成功率较高这一特点已被许多植物胚乳培养实例所证实，如玉米、柑橘、苹果、梨等 植物种类不同，传粉后胚乳进入细胞期的时间不同，胚乳细胞终止有丝分裂的时间不同玉米胚乳在授粉后3-5D进入细胞期，8-12D胚乳细胞处于旺盛细胞处于旺盛分裂期，22D胚乳核有丝分裂 几种植物胚乳双受精后进入细胞期的时间¨ 梨（锦丰、早酥） 20d¨ 黑麦草 8－10d¨ 小麦 5d¨ 大麦 5d¨ 黄瓜 7－16d (二) 胚性因子的作用 胚乳组织培养中，一个值得注意的问题，即在诱导胚乳组织增殖，形成愈伤组织时，必须要有胚的存在当愈伤组织形成后，除去胚并不影响胚乳组织的增殖胚对胚乳的增殖作用，有人认为是某种“胚性因子”在起作用 “胚性因子”究竟是什么？ 用巴豆（Bhojwani，1968）、核实木和蓖麻（SriVastava，1971）为实验材料，将成熟胚乳组织片，在培养之前先用不同浓度的GA3，或IAA进行浸泡预处理12 h、24 h、36 h、48 h，然后转移至如下两种培养基上：①IAA＋KT＋CH（水解酪蛋白）；②2，4-D+酵母提取物进行培养。
发现用1－2mg／L GA3（赤霉素）浸泡36 h的核实木的胚乳组织，在无胚的情况下，可形成愈伤组织并分化出绿色芽体苹果（母锡金，1977）的胚乳培养中亦有类似的情况说明植物激素对胚乳的增殖和分化的作用柚子胚乳培养中，无论带胚或不带胚均可获得愈伤组织并分化成植株不过所用的培养基中均具有赤霉素，故认为这种“胚性因子”就是赤霉素当然GA的作用仍需继续探讨（王大元，1977） 有人在培养葡萄和苹果未成熟胚乳组织（细胞期软组织）时，证明胚乳细胞的增殖和器官分化并不需要胚的存在后来发现在柚子、水稻、大麦未成熟胚乳培养中亦有类似情况胚性因子”究竟是什么？植物激素是肯定的，至于哪些激素在胚乳培养中，可起到“胚性因子”的作用，还要看植物体内内源激素的种类和含量才能判断 (三)培养基酸碱度对胚乳组织培养的影响 根据不同植物种类进行pH值调节，不同植物种有其最适应的pH值®玉米6.l－7.0 核实木5.6 ®蓖麻5.0 苹果6.0－6.2 ®麻疯树5.2 巴婆4．0 7.4 7.4 植物的离体受精植物的离体受精7.4.1 7.4.1 离体受精的概念和意义离体受精的概念和意义 从花粉萌发到受精形成种子，从种子萌发到幼苗形成的整个过程，均在试管内完成，称离体受精，或试管受精。
离体受精技术在克服植物受精不育障碍，特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发后花粉管不能伸入花柱，或在花柱中生长缓慢，使配子不能如期融合的障碍有着极其重要的意义 重要作用有如下三点：①可以克服自交不孕；②使亲缘关系更远的植物进行种间或属间杂交；③诱导孤雌生殖1990年管启良等进行大麦和硬粒小麦属间试管受精，得到了试管种子和幼苗 7.4.2 7.4.2 离体受精的方法离体受精的方法 将未授粉的子房，经表面灭菌后，切开取出胚珠，接种在培养基上然后，在试管内撒播花粉花粉发芽后，花粉管长人胚珠内受精受精后的胚珠进一步发育形成种子种子能在培养基上发芽长成植株 具体作法有5种（1）从胎座上切下单个胚珠（裸露胚珠），接种在培养基上，然后撒播花粉的方法2）带着完整胎座或部分胎座接种并撒播花粉的方法3）带着完整子房或部分子房壁接种并撒播花粉的方法由于带着完整子房，对于解决花粉和柱头，花粉管和花柱两种形式的受精障碍不起作用故发展到切去柱头和花柱直接在子房上散布花粉的作法如烟草试管受精 （4）柱头接近法将花粉撒在本种植物的柱头上，切下柱头接种在培养基上然后在柱头周围，接种异种裸露胚珠，花粉在本种植物的柱头哺育下发芽，花粉管伸长并进人胚珠受精。
这一方法是解决花粉发芽和胚珠培养，在培养基组成上发生矛盾时，所采用的一种方法5）哺育法将胚珠表面先蘸满有助于花粉发芽的培养基接种培养，然后在胚珠上撒播花粉使之受精这一方法是解决胚珠存活率和花粉发芽、花粉管伸长培养基发生矛盾时的作法 7.4.3 离体受精成功的技术关键(一) 离体胚珠的成活率和受精力试管受精的成功率与胚珠的成活率有着密切关系提高离体胚珠成活率的关键是培养基关键是培养基因此要对培养基的各种成分进行详细的筛选诸如基本培养基、激素种类和浓度、渗透压、pH值等 适宜胚珠离体培养而且成活率很高的培养基，往往不能使花粉萌发或不能使萌发后的花粉管伸长其结果即使撒播花粉，也不能使胚珠受精这一特点在多数植物种中被发现为此需同时筛选有利于花粉萌发和花粉管伸长的培养基 (二) 花粉萌发和花粉管的生长速度 试管内撒粉后，如何保证花粉迅速发芽，并且有较高的发芽率；花粉管能迅速伸长并在受精允许的时间内到达胚囊，其关键仍然是培养基因此需对花粉萌发和花粉管伸长的适宜培养基进行筛选培养基筛选中要注意钙和硼对促进花粉萌发和花粉管伸长的作用 (三) 花粉的灭菌 试管受精是在无菌条件下进行，所以花粉必须先进行灭菌。
目前常用的花粉灭菌方法如下：(1)用新鲜花蕾浸渍灭菌，然后剥出花粉使用由于花粉粘连，撒播不均匀，因而影响撒播质量如若待药囊自行裂开后再用，但又不能保证花粉具有高的萌发率和受精力（率）(2)紫外线照射灭菌，照射时间约15min，但灭菌效果和受精率有一定的矛盾，因此要在灭菌率、发芽率、受精率三者之间筛选最适宜的照射时间 （四）鉴别受精的标记性状（四）鉴别受精的标记性状 试管内的胚珠撒播花粉后，如何辨别受精与否呢？那就需要标记性状经对受精后标记性状的研究发现，对多数植物来说寻求适宜的标记性状是极不容易的事对于没有标记性状的植物，只能等待最后结果，因而鉴别受精与否的时间较长 玉米“胚乳直感”现象，是试管受精的优良标记性状选用具有紫色胚乳的品种为父本，采用白色胚乳的品种为母本受精后如F1代胚乳表现紫色，证明试管受精成功所得结果无需进行其他鉴定 目前建立单个（裸露）胚珠的培养技术，尚有许多困难特别是对受精后不久的胚珠（早球胚期）的营养需要尚不清楚因此对胚珠培养的培养基的研制仍处于盲目阶段 复习思考题复习思考题 植物胚胎培养分为哪些类型？各有何特点和要求？胚胎培养有何重要意义？ 。