实验目的1. 了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2•学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3. 学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4. 学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质 实验原理1. 外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中 让其在E. co〃中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子在不加诱导剂的 条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基 因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与 lac 操作子结合，外源基因就表达2. 蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方 式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量其分离原理是根据蛋白质 分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二 级、三级、四级等结构，并便DS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳 定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量 的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略 不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子 质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3. 考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝 是一种蛋白质染料，主要有 R-250 和 G-250 两种类型考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸 残基（Arg， Trp， Tyr， His，Phe）结合考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰 胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色;因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red,偏红， 红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染 色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色4. 基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架 的表达产物是一个杂和蛋白在E. coli的pET表达系统中表达N端含有His-tag（组氨酸六聚体）的融合靶蛋白，然后用亲和层析的方法进行纯化 多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，因此带暴露的 6 X His-tag 的蛋白质能结合于固化Ni2+树脂，从而将带有his-tag组氨酸标签的融合蛋白与 其它蛋白区分开来组氨酸残基的五元咪唑环是蛋白与Ni离子作用的关键当 我们用高浓度的咪唑（imidazole）溶液洗脱的时侯，咪唑便与融合蛋白his-tag的 咪唑环竞争结合，最终将融合蛋白洗脱下来。
5. 蛋白质杂交法：蛋白质杂交也称Western blotting，首先是要将电泳后分离的蛋 白从凝胶中转移到 PVDF 膜上，本实验使用电泳印迹湿转法这种方法是用有孔 的塑料和泡沫将凝胶和 NC/PVDF 膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极 中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用 下离开凝胶结合到PVDF膜上转移后PVDF膜就称为一个印迹(blot),用于对 蛋白质的进一步检测印迹首先用蛋白溶液处理以封闭 PVDF 膜上剩余的疏水 结合位点，而后用一抗处理，待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合 物，清洗除去未结合的一抗，进一步用适当标记的二抗处理，带有标记的二抗与 一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置实验仪器与材料、试剂1.实验仪器：超净工作台、试管、摇床、离心机、垂直板电泳仪、空气浴摇床、 低温离心机、电泳仪、超声破碎仪等2•实验材料：大肠杆菌BL21 ；重组质粒pET-X, PVDF膜3.实验试剂：( 1 ) 50mg/ml 卡那霉素 2) 1M IPTG：( 3) LB 液体培养基(4) 蛋白质 Marker(5) 30％ Acr/Bis (丙烯酰胺溶液(6) 1.5 M Tris-HCl(pH 8.8)：(7) 0.5 M Tris-Hcl(PH6.8)：⑻10% (w/v) SDS (十二烷基磺酸钠)溶液：(9) 10%AP (过硫酸铵溶液,AP(10) TEMED ：商品液。
11) 10X 电泳缓冲液 (12)(13) 1 膜转移液(1000 ml)：( 15)洗膜缓冲液 TBST(16)封闭液 (3% BSA)(100ml)(17) 3ml, NaCl(18)显色液(10 ml)：(19)染色液(100ml( 20)脱色液( 200ml)实验步骤：71.外源基因的表达(1) 种子液的制备：挑取LB固体平板上的大肠杆菌BL21 (pET-X)单菌落， 接种于含5卩1卡那霉素的5ml LB液体培养基的试管中，37°C, 200rpm振荡培养 过夜注意取菌株要在超净工作台上操作，一定注意无菌).(2) 转接培养：取50卩1菌液分别转接到两支含有5卩1卡那霉素的5ml LB液体 培养基试管中(1%接种量)，37C、200rpm转接培养3) IPTG诱导表达：当培养2-3小时，使其OD6o0值达0.6左右，开始向一支 试管中加入5u1 1M的IPTG (终浓度为1mM)进行诱导表达6小时，另一支试 管作为对照不加 IPTG4) 取样：诱导表达 6 小时后，取 1.m1 菌液， 12000rpm 离心1 分钟，弃上 清，收集菌体沉淀20C保存1.1. 蛋白质变性SDS-PAGE电泳分离⑴样品制备：取出-20C保存的BL21 (pET- cry9ea菌体沉淀，加入50卩1 20m M Tris-HCl (pH &0)重悬沉淀与2X上样缓冲液1:1混匀，同蛋白Marker 一起在 100C沸水浴10分钟，12000r/min4C离心5分钟，冰上放置。
2) 10%分离胶制备(5m1):架好胶板(使用0.75mm的玻璃板)，配置10% 分离胶：去离子水 1.9 m1， 30％Acr + Bis 1.7 m1， 1.5 M Tris-Hc1(pH 8.8)1.3 m1，10%SDS 50 u1，10%AP 50 u1，TEMED 3 ul注意：最后加 AP 和 TEMEDo混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水，约40分 钟，等胶自然凝聚后倾斜倒出蒸馏水(在胶面上加入蒸馏水称为水封，其目的是 保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶）3） 5%浓缩胶制备（2ml）:去离子水 1.4ml, 30%Acr-Bis 0.33ml,0.5M Tris- Hcl（PH6.8） 0.25ml, 10% SDS 20 ul, 10% AP 20 ul,TEMED 2 ul混匀后加入到 玻璃板中，并插入0.75mm梳子，待凝固后小心拔出梳子 4 ）上样:蛋白上样量的选择:要根据具体情况决定，对于考马斯亮蓝染色， 如果样品为菌体蛋白样品，有至少50条以上的条带要显出来，需要上样量在15 pg左右即可，如果蛋白条带少于6条，如蛋白Marker或纯化阶段后期的蛋白样 品，上样量可减少至2 pg即可显出清晰的条带。
5）电泳：将玻璃板凝胶放入电泳槽中，并在糟中加入1X电泳缓冲液加样： 取所制备样品上清20ul，蛋白Maker 5 ul分别上样设定电泳程序：S1 80V 15min； S2 160V 1h30min1.1.1. 考马斯亮蓝染色检测蛋白质染色和脱色：电泳结束后，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取出凝 胶，放入考马斯亮蓝染色液中，脱色摇床染色（或于微波炉加热至染色液沸腾） 约2小时将凝胶转入另一培养皿，加入脱色液（用沸水煮沸脱色后），脱色摇 床脱色2次，第一次1 个小时，第二次0.5个小时左右，即可观察蛋白条带 1.2蛋白质的纯化-镍柱亲和层析1. 取出-20°C保存的E. coli BL21/pET-X菌体沉淀（1000^1菌液），加入1/10体 积的结合缓冲液【0.1M Tris-HCl （pH8.0）】（100^1）,重悬细胞沉淀，加入1 口1 的溶菌酶至终浓度为100 口 g/ml，冰上放置30分钟；2. 超声波处理50次（超声5秒/间10秒，约5分钟）；3. 12000r/min，4 C离心15分钟，取上清和沉淀物；4. 除上清外，所有样品均加入100ul结合缓冲液，充分混匀。
5. 取 beads 30-50 口 l6. 加入500 ul去离子灭菌水，静音混合器混匀20分-1小时，多次离心换水，至 pH7.0.7. 挂镍，离心去水，加入1M硫酸镍500 ul，静音混合器混匀20分-1小时，2 次离心换硫酸镍缓冲液，至 pH2~3.8. 500u l 去离子灭菌水，静音混合器混匀 20 分-1 小时，多次离心换水，至 pH7.0.9. 离心，加入500 ul, 10mM Tris-HCl （pH8.0 ）溶液平衡beads，静音混合器混 匀 30 分10. 离心，200 ul 含 0.5M 氯化钠的 10 mM Tris-HCl （pH8.0）溶液平衡beads，静 音混合器混匀 30 分11. 稀释样品至200 u l，然后在样品中加入氯化钠，至终浓度为0.5M12. 取beads约10ul，加入稀释样品中，4C，静音混合器混匀1-2小时13. 离心，去上清，用含0.5M氯化钠的10mMTris-HCl （pH8.0）溶液洗beads， 每次 500u l， 2-3 次，至 OD 很低且稳定14. 15mM 咪唑0.5M氯化钠的10mMTris-HCl （pH8.0）溶液（用前配置），20 口 L,静音混合器混匀1小时，离心取上清。
15. 60mM 咪唑0.5M氯化钠的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液（用前配置），20 u L,静音混合器混匀1小时，离心取上清16. 300mM 咪唑 0.5M 氯化钠的 10mMTris-HCl （pH8.0）溶液（用前配置），20 u L,静音混合器混匀1小时，离心取上清17. SDS-PAGE 电泳检测1.2.1 蛋白质杂交检测蛋白质（ 1 ）蛋白质转膜：a. 准备好转印缓冲液，把凝胶在膜转移缓冲液中平衡60min；b. 剪好合适尺寸的转印膜（PVDF膜），先在甲醇中浸10 min，转至膜转移缓冲 液浸lOmin；c. 剪好合适尺寸的滤纸（2张增厚滤纸或4张厚滤纸或6张薄滤纸）用膜转移缓冲 液浸湿；d. 在转膜仪的阳极平板上根据图中顺序做好转印三明治，注意不能有气泡；e. 装好阴极平板，合上安全盖；f. 接上合适的电泳仪开始转印，注意电极连接（正对正，负对负）100V, 45min， 冰上进行g. 关闭电泳仪，打开安全盖和阴极电极，取出转印膜；（ 2）封闭及杂交：h. 用膜转移缓冲液漂洗10min，置于1%封闭液（blocking buffer）中，室温，缓 慢摇动45-60min，或者4°C过夜；i. 加入稀释于3%封闭液的第一抗体，室温，缓慢摇动45~60min，或者4C过夜；j. TBST 洗 4 x 5min，TBS 洗 1 x 5min；k. 加入第二抗体（碱性磷酸酶编辑的抗鼠IgG）,缓慢摇动45-60min；l. TBST 洗 4 x 5min，TBS 洗 1 x 5min；（ 3）显色反应：m. 加入10ml包含显色底物（NBT-66M、BCIP-33pl）的检测液（显色液），室温， 避光，静置，观察颜色反应；n. 信号达到要求后，清水漂洗，终止反应，避光、晾干。
实验结果与分析第一次烤染（总蛋白质）KDa116.09L2每个组都得到了很多条带，说明每个组都得到了许多分子量不同的蛋白质；每个组跑出的 带。