咖啡叶片 DNA 微量提取1 CTAB 法提取参照 Paillard (1996)，Agwanda (1997)，郭景伦 (1997)，朱旗(1994)等的方法进行多次实验后改进，形成 CTAB 法改进 III，具体步骤如下：1）取半成熟新鲜叶片 2~3 cm2（0.15~0.3 g） ，剪碎后在液态氮中研磨成细粉2）立即依次加入 0.1 g PVP 粉混匀，1 ml 氯仿混匀，2 ml Extraction buffer（350 mM 山梨醇， 100 mM Tris-HCl pH8，100 mM EDTA pH 8.0，0.5% 重硫酸钠） ，添加 40ul β–巯基乙醇（终浓度 2%）混匀3）融化后的糊状物分装于 2 ~ 3 支 1.5 ml 的离心管，离心 10 min（at 4℃，5000 rpm） 4）吸弃上层液相和下层氯仿5）每管沉淀物加入 600 ul lysis buffer [0.2 M Tris-HCl(pH8.0), 0.05 M EDTA, 2 M NaCl, CTAB2%]，添加 12 ul β–巯基乙醇（终浓度 2%）,轻轻混匀后 65℃下温育 0.5 h。
6）添加等体积的氯仿 ：异戊醇（24:1， v/v） ，小管倒转约 10 次(充分混匀)，形成乳状液后离心 15 min（at 4℃, 12000 rpm ） 7）上层水相转移到一个新的 1.5ml 小管，加入 1/10 体积的 3 M 乙酸钠、等体积（600 ul）冷的乙醇，离心 10 min（at 4℃, 6500 rpm） 8）弃液相，用 70％的乙醇中洗涤沉淀物 2 次，然后悬浮在 100 ul 的 TE中（如难溶解则在 65℃水浴中处理 10 min） 2 DNA 纯化1）将粗提取 DNA 用 TE 稀释至 600 ul，加入 1.5 ul 10mg/ml 的 RNase 母液（相当 15ug RNase） ，在 37℃水浴下处理 30 min2）添加等体积的氯仿:异戊醇 (24:1)，倒转混匀后离心 15min（at 4℃，12000 rpm） 3）吸取 500ul 上清液，重复“2） ”4）吸取 400ul 上清液，加入 1/10 体积 3M NaAc，等体积的冷的无水乙醇，轻轻混匀后离心 10min（at 4℃，6500 rpm） 5）加入 200 ul 70％的乙醇洗涤 2 次，弃乙醇，将管倒扣于滤纸上，使乙醇流尽。
6）风干（或自然凉干） 7）DNA 悬浮在 100ul 的 TE，4℃保存（常用） ，-20℃长期保存3 DNA 质量检测1）取 2~5ul DNA 用 TE 缓冲液稀释至 50ul，于 Beckman 公司生产的紫外分光光度计（DU530 DNA/Protein Analyer）中检测 OD 值2）取 10ul 样品 DNA 与 2 ul（6×）Loading buffer [0.25% 溴酚蓝，40%（ m/V）蔗糖] 混匀，于 1%琼脂糖凝胶上进行电泳，同时点上 50ng Marker，检测 DNA 分子的大小3）用无菌重蒸水将检测合格的 DNA 样品稀释到 50 ng·ul-1，常用的放在4℃冰箱,长期保存的放在-20℃或-70℃冰箱，保存备用4 咖啡植物总 DNA 提取技术研究实验结果图 1 咖啡叶片微量提取 DNA 电泳图谱（1%琼脂糖）图 1：I 不同改进的 CTAB 法提取 DNA；1、2：CTAB 法改进 I 提取的DNA；3、4：CTAB 法改进 III 提取的 DNA；5、6：CTAB 法改进 II 提取的 DNA图 1：II SDS 法和 CTAB 法改进 III 提取 DNA； 1~4：SDS 法提取的 DNA；5~8： CTAB 法改进 III 所提取的 DNA。
图 1：III 不同成熟度叶片 CTAB 法改进 III 提取 DNA；1：0.1g 半成熟叶片提取的DNA，2：0.1g 嫩叶片提取的 DNA，3~5：0.1 g 成熟叶片提取的 DNA1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 MI II III。