大蒜SOD的提取与分离第九组：赵曙光 李娜 刘鲁实验目的1. 学习超氧物提取物的分离方法2. 通过大蒜细胞SOD的提取与分离3. 学习和掌握蛋白质和酶的提取与分离的基本原理和操作方法实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶它可催 化超氧负离子（0 2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞 中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出由于SOD 不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如 核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等这些指标在一 定程度上反映衰老过程的变化近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内 自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过 氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡由于超氧自由基（O）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法并 利用各种呈色反应来测定SOD的活力核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O， 当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成 二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。
当加入SOD时，可以使超氧 自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了 NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成 速度减慢通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各 液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为 横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据 SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50% 时的酶量作为一个酶活力单位（U）实验器材冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒、胶头滴管、电子天平、移液 管实验药品新鲜蒜瓣0.05mol/L磷酸缓冲液（pH=8.2） Tris氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5丙酮：用前需预冷至4-10°C0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）2mmol/L邻苯三酚实验步骤1、 组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨2、 SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续 研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。
3、 除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min, 5000rpm离心15min, 得到的上清液为粗酶液4、 SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min, 得SOD沉淀将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)中，于55-60°C热处理15min, 得到SOD酶液5、 SOD活力测定将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力试剂空白管对照管样品管pH=8.2碳酸缓冲液(Tris)3.03.03.0蒸馏水2.01.81.7样品液000.1混合均匀静止室温20min邻苯三酚00.20.2加入邻苯三酚迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，在420nm测吸光值实验结果试管空白管对照管样品管吸光值00.0760.061实验讨论注意事项1. 酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心2. 肾上腺素邻苯三酚容易被氧化，故操作时要尽量快。