汉恒生物基于Gibson Assembly的无缝克隆快速设计教程软件：Genome Compiler设计举例：把LacZ克隆到pEGFP-N3中，得pLacZ-EGFP难点：LacZ需要和EGFP融合表达，所以克隆位点的选择尤其关键！注：Snapgene也可以设计，容后开篇介绍1. 下载pEGFP-N3的载体文件我们推荐从Snapgen网站下载导入到Genome compiler中（如图1）LacZ序列软件本身就有，可以搜索得到 图12. 点击File-new construction project, 再点击下面的Gibson Assembly进入（图2）图23. 把Backbone pEGFP-N3拖入，载体信息会完全展示出来，包括序列、图谱和各种注释（图3-4）点击sequence和circular可以在质粒的序列和图谱之间切换，方便查看图4所示的是我们选中对多克隆位点MCS的序列展示 图3图44. 图4之间有一些选项：快速克隆首先需要对载体进行线性化处理通常有2种方法：双酶切线性化和PCR线性化本次教程我们来讲双酶切线性化5. 本例是做融合蛋白的克隆构建，所以必须考虑读码框的问题。
简而言之，就是要融合表达的两个蛋白之间间隔的碱基数必需是3的倍数，比如9bp，15bp，21 bp这样子，而且不能含有终止密码子Stop Codon-TAA，TAG和TGA6. 鉴于此，我们选择双酶切的时候一定要足够小心，确保满足第6条的标准比如在本例中我们选择NheI和BamHI(如图5)，BamHI识别序列为GGATCC 6碱基限制性内切酶，编码两个氨基酸G和S，因此，可以作为读码框的一部分而BamHI识别位点GGATCC距离下游GFP的举例为15bp，刚好包含5个氨基酸GSIAT（如图15）如果不能完美对框，比如距离为14bp，则需要在引物合成的时候补上1个（非终止密码子）碱基，如果是13bp，则需要补2个（非终止密码子）碱基等图57. 然后我们选中NheI，会自动出来下面的选项，酶切位点的处理方式，包括不处理Non processed（不处理），regenerate（再生）和 Eliminate（去除）我们选择regenerate（再生），这样保证构建的克隆酶切位点可以恢复（图6）同样的，下游的酶切位点也同样处理然后点击下一步图68. 这一步是选择insert（插入片段）我们选择”Add fragment“（图7）。
把LacZ文件拖进去（图8）.中间可以对插入片段重命名，位置也可以自由定制（本例中选择的时候注意不要带Stop Codon）本例LacZ序列不带stop condon，我们选择select all即可如果是做多片段组装，方法同上需要对齐读码框的请一定格外小心点击下一步图7图89. 这一步就进入引物设计设计阶段默认重叠序列15-25 bp，TM值在50度（图9）点击run assembly引物序列就设计好了（图10）.但我们不着急，继续下一步图9图1010. 下一步就把克隆虚拟组装好了（图11）但我们一定要check一下读码框是否和我们预想的一样正确我们选中LacZ-EGFP序列然后选中Annotation layers，点击ORF旁边的小齿轮进入设置（图12，13）因为这个融合读码框很大（超多600个氨基酸），我们范围也选定到大于600 aa点击确认（图14）图11图12图13图1411. 图14图谱中会出现一个环形箭头，代表一个ORF我们切换到序列，找到LacZ和EGFP的融合出看看细节（图15）箭头分别指示了3个ORF—LacZ，EGFP和LacZ-EGFP融合，发现融合以后两者的读码框严格保留，而中间就多了GSIAT 5个氨基酸。
说明和我们预想的一致，设计ok点击完成即可图1512. 完了保存引物会在图谱里面显示出来切换到线性图谱模式，选中引物，右键选择“copy primer content“到文件里就是引物序列直接合成即可，但请check引物方向和正义链反义链（图16）图 1613. 然后引物合成回来以后按照说明书做克隆构建即可。