DNS法分析蛋白质N-末端氨基酸• 标准氨基酸和所分析蛋白质的DNS化 • DNS蛋白质的酸水解（水解管封管、温度等 ） • 聚酰胺薄膜层析（展层剂的选择和配制、毛 细管点样、展层装置） • 紫外灯下的观察蛋白质结构分析有关方法• 蛋白质要求很纯 • 一级结构分析（氨基酸序列分析）：N、C- 末端的测定判断肽链数；拆分肽链；各肽 链氨基酸序列分析；二硫键位置的确定 • 立体结构分析：各种光谱分析；X-光衍射 分析；质谱及核磁共振等分析有关资料序列测定（sequencing）已有50多年的历史，但开始时进展 十分缓慢最初，人们致力于建立蛋白质和多肽的分离技 术，并确定其氨基酸种类及含量1945以前，没有任何蛋白 质序列定量测定的方法以后十年中，由于色谱技术和标记 方法的快速进展，第一个多肽激素（胰岛素）的全序列测定 于1955年完成（Ryle等，1955）五年后，第一个酶（核 糖核酸酶）序列测定完成（Hirs等，1960年）1965年，约 有20个含100多个残基的蛋白质序列被确定截止1980年， 这一数字已达1500个而今天，已测定的蛋白质序列已达30万个，这在50年前是难以想象的 最初，蛋白质序列测定主要采用手工的埃德曼降解和环甲基 化（Edman deglation - dansylation）方法（Edman，1950 年）。
蛋白质序列测定的快速进展，应该归功于自动测序仪 的研制成功与埃德曼和贝格于1967年发明的测序法相比， 1980年开始使用的自动测序仪的灵敏度提高了近1万倍质谱技术的发展为蛋白质序列测定开辟了新的途径第一次 用这种方法测定完整的蛋白质分子是在1997年质谱法测序 的突出优点是可以识别翻译后修饰而得到的特殊氨基酸用 其它方法进行蛋白质序列测定时，这种修饰信息无法获得 正是利用了质谱技术，人们得出了r-氨基丁酸处于凝血素N- 末端的重要结论DNS法分析蛋白质N-末端氨基酸的原理蛋白质的α-氨基与丹磺酰氯（DNS-Cl是一种荧光物质）在碱性条件下反应，生成DNS-蛋 白质，经酸水解可生成DNS-氨基酸通过聚酰 胺薄膜层析分析DNS-氨基酸，可确定蛋白质的N -末端氨基酸此法灵敏度高，也可用于蛋白质 的氨基酸组成的测定1、α-氨基与丹磺酰氯的反应反应条件：pH9.0-9.5，室温2-4小时或40℃中反应2小时2、 DNS-蛋白质的酸水解1、DNS—氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除 DNS—色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％) ，甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破坏外，其余DNS—氨基酸很少破坏。
2、DNS—C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏； DNS-ε-赖氨酸和DNS-O酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨 酸和DNS-双-酪氨酸生成，层析后在层析图谱的位点上，都与 DNS-α-氨基酸有区别3、DNS-C1在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，在DNS-C1 过量时，会产生DNS—NH2，DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现 黄色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开 3、乙酸乙酯抽提 DNS-氨基酸在酸性条件下(pH2～3)一般都可被乙酸乙酯 抽提，然后取乙酸乙酯层点样层析，这样大量DNS-C1的 反应副产物DNS-OH可留于水相，干扰因素减少，所得层 析图谱清晰但若是DNS-精氨酸，DNS-天冬氨酸，DNS -谷氨酸，DNS-苏氨酸，DNS-丝氨酸则它们大部分或部分 留于水相，往往会被遗漏，而导致错误结论这时可将样 品浓缩干，用甲醇直接溶解后点样，由于上述DNS-氨基 酸的层析位置都位于DNS-OH的下侧，影响不大，这一点 在测定多肽或蛋白质的N末端时要特别注意1、DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄 膜上检测灵敏度为0．01μg(相当于10—10mol)。
聚酰胺薄 膜层析是1966年后发展起来的一种新层析技术由于它具 有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛 应用于各种化合物的分析 2、聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)，对极性物 质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键这种氢 键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大 小层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢 键因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附 、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能达到分离物 分离的目的 3、聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶薄膜制成的4、聚酰胺薄膜层析实验方法聚酰胺薄膜层析 点样 层析注意事项1、点样斑点不宜太大，用毛细管可分2-3次点，点 一次吹干一次 2、层析时层析液不能没过斑点，要在斑点以下 3、观察时，用铅笔圈好黄色亮点思 考• 网上查询蛋白质结构分析最新动态． • 薄膜层析与其它层析法比较有那些优点？ • 选用展层剂的依据是什么？。