捅矍R G D 毒素肽为一类含R G D 模体序列的小分子量蛋白，其可凭借蛋白质一级结构上特有的R G D 分子序列而成为细胞外基质( E c M ) 与细胞整合素( in t e g r i ／3 ) 阃结合的强效竞争性拮抗剂⋯进而通过封闭整合素的信号转导通路而起到抑制血小板聚集、抑制血管新生和抗肿瘤细胞增殖等作用“2 1 本课题组已先期完成七鳃鳗唾液腺c D N A 文库的构建随机挑选单克隆单向测序后，共得到1 2 8 1 条有效E S T 序列”1 对其进行生物信息学分析后，发现了三条能翻译出R G D 模体的开放阅读框，确定了三条R G D 模体毒素肽候选基因L a m p e t r i n i 为源自于日本七鳃鳗口腔腺，富含半胱氨酸并具有R G D ( A r g —G 1y - A s p ) 特征性模体的基因重组蛋白，其具有R G D 毒素肽 的典型特征，且与其它家族R G D 毒素肽在一级结构上没有同源性从日本七鳃鳗口腔腺中提取总R N A 进行R T —P C R 扩增，获得了4 2 3 b p的月本七鳃鳗R G D 毒素肽基因对此一毒素肽基因进行克隆、转化与诱导后，得到了该蛋白的可溶性高效表达。
经组氨酸亲和层析纯化，获得了分子量为1 6 ．9 k D a 的均质蛋白，并将其命名为L a m p e t r i n l 活性测定结果显示，L a m p e t r i n l 能呈剂量依赖性方式抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管新生及A D P 诱导的兔血小板的聚集作用，具有R G D 毒素肽的典型活性L a m p e tr i n l 对7 7 2 1 肝癌细胞增殖有明显的抑制作用，1 1 ) 5 0 为2 ．6 4 p m 0 1 ／L 这可能是由于L a m p e t r i n l 通过结合细胞表面的整合素，而阻断下游的信号转导通路而引起细胞发生凋亡在对L a m p e t r i n l 作用的7 7 2 1 肝癌细胞进行H o e c h s t 染色也证明了这一推测1 ．3 7 肛m o l ／L 的L a m p e t r in 1 可引起细胞的凋亡，对凋亡细胞处理后，提纯D N A ，进行琼脂糖凝胶电泳和E B 染色后，在凋亡细胞群中可观察到典型的D N A l a d d e r 恶性肿瘤的～‘个重要的生物学特征是对其邻近正常组织的侵润及远处转移模仿肿瘤细胞入侵E C M 的三个步骤，设计的体外试验结果表明，L a m p e t r jn l 可抑制7 7 2 1 肝癌细胞对人j ：基质膜m - a t r i g e l的黏附、抑制其向b F G F 的迁移和透过m a t r i g e l 的侵润。
这表明iL a m p e t r ir 1 1 具有抑制7 7 2 1 肝癌细胞侵入F C M ，进而抑制其转移的作用重组L a m p ec r i l l l 具有R G D 毒素肽的典型功能，有望发展成为一种抗肿瘤新药，具有潜在的临床应用价值同时制备了基因重组蛋白L a m p e t r i n l 的多克隆抗体，为L a m p e t r i n l 功能基因与蛋白的筛选与确认打下了良好的基础本课题的完成，将是首次在日本七鳃鳗这一物种中发现并确认R G D 毒素肽功能新基因，为R G D 毒素肽家族增添源于不同物种的新成员，为闩本七鳃鳗的功能基因组学与蛋白质组学研究奠定理论基础，为利用其进行抗血栓、抗肿瘤基因工程药物开发提供详尽的科学依据关键词L a m p e t r i n l ，R G D 毒素肽，整合素，血管新生，血小板聚集2A b s tr a c tR G Dp e p t i d e sa r es m a l lm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i n sw h i c hc o n t a i nR G Ds e q u e n c e ．A sac o m p e t i t i v ea n t a g o n i s t ，i tc a ni n t e r f e r et h ec o m b i n a t i o nb e t w e e nt h ee x t r a c e l l u l a r ．m a t r i xa n dc e l l si n t e g r a t i o nb yt h e i rs p e c i f i cR G Ds e q u e n c e D l ．M o r e o v e r ，R G Dp e p t i d e sa l s oc a ni n h i b i tp l a t e l e ta g g r e g a t i o n ，a n g i o g e n e s i sa n dt u m o rc e l lp r o l i f e r a t i o n1 1 。
2 】b yc l o s i n gi n t e g r i ns i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y ． Ae D N Al i b r a r yw a sc o n s t r u c t e df r o mt h eo r a l g l a n do fL a m p e t r aj a p o n i c a ．1 2 8 1v i r t u a lE S T s l 3 1w e r ef o u n d e da f t e rr a n d o ms e l e c t i o no fc l o n e sf o rs e q u e n c i n g ，B i o i n f o r m a t i c a la n a l y s i ss h o w e dt h r e eR G Dp e p t i d eg e n e sa n dt h r e eo p e nr e a d i n gf r a m e sw h i c hc a nt r a n s l a t eR G Dm o t i f ．L a m p e t r i n li sar e c o m b i n a n tp r o t e i no fR G D —p e p t i d ef r o mL a m p e t r aj a p o n i c a ．I nt h i ss t u d y ，t o t a lR N Aw a se x t r a c t e df r o ms a l i v a r yg l a n da n dw a sr e v e r s e l yt r a n s c r i b e dt oc D N A ．B ya m p l i f y i n g ‘o fc D N A ，w eo b t a i n e dL a m p e t r i n l ’Sg e n ew i t h4 2 3 b p ．S e q u e n c i n gi n d i c a t e dt h a tL a m p e t r i n lw a sn o n ·h o m o l o g yw i t ho t h e rR G D —p e p t i d ef r o mo t h e rs p e c i e s ．L a m p e t r i n lc o n t a i n sm o t i f - R G D ．A f t e rc l o n i n g ，t r a n s f o r m i n g ，a n de x p r e s s i o no fL a m p e t r i n lg e n e ，t h eL a m p e t r i n lw a sp u r i f i e d ．T h es o l u b l eh o m o g e n e o u sp r o t e i nw a so b t a i n e da n dc o u l ds i g n i f i c a n t l yi n h i b i ta n g i o g e n e s i so f7 - d a y s —o l dc h i c ke m b r y o sa n da g g r e g a t i o no fr a b b i tp l a t e l e ti n d u c e db yA D P ．T h er e s u l ts h o w st h a tl a m p t r i n lh a ．st y p i c a lR G D ·p e p t i d e s ’f u n c t i o n s ．L a m p e t r i n lc o u l di n h i b i tp r o l i f e r a t i o no fS M M C - 7 7 2 1c e l l s ，t h eI D S 0v a l u eo fL a m p e t r i n lw a s2 ．6 4 ／z m o l ／L ．T h er e a s o nm a y b ei sL a m p e t r i n1c a nb i n dw i t hi n t e g r i nw h i c ho nc e l ls u r f a c et op r e v e n tt h ed o w n s t r e a ms i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y ，a c c o r d i n g l yi n d u c ea p o p t o s i s ．L a m p e t r i n lt r e a t e dS M M C - 7 7 2 1c e l l sw e r es t a i n e dw i t hH o e c h s t3 3 2 5 8 ，af l u o r e s c e n tD N A - b i n d i n gd y e ，t oi d e n t i f yt h ea p o p t o t i cn u c l e i ．T h i sr e s u l ta l s od e m o n s t r a t e dt h a tL a m p e t r i n Ia tt h ec o n c e n t r a t i o no f1 ．3 7 ／“m o l ／Lc o u l di n d u c ea p p p t o s i si nS M M C 一7 7 2 1c e l l s ．E x t r a c t i n gD N A ，b ym e a n so fa g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sa n de t h i d i u mb r o m i d es t a i n i n g ，w ec a ns e et y p i c a lD N Al a d d e ri na p o p t o s i sc e l ll i n e s ．A ni m p o r t a n tb i o l o g i c a lf e a t u r eo fm a l i g n a n c yi st h ei n v a s i o na n d3t h et r a n s f e rt oa d j a c e n tn o r m a lt i s s u e ．I m i t a t i o nt h et h r e es t e p so ft u m o re e l li n ．b r e a kE C M ．W ef o u n。
