第十五章丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和组氨酸发酵- 1 - 第十五章丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和组氨酸发酵第一节丙氨酸发酵丙氨酸 (Alanine ，A1a)，亦称 α -氨基丙酸 ( α -aminopropionic acid)，具有甜味，常用作调味料霉菌、酵母、细菌、放线菌等微生物都能够由糖类和无机氮源、有机氮源发酵生产L-丙氨酸 这就是所谓的直接发酵法后来又开发了酶法及固定化法等，原料则使用延胡索酸或 L-天冬氨酸发酵法生产 L-丙氨酸， 主要是以降解葡萄糖等碳源生成的丙酮酸为底物，经过氨基转移反应或还原氨基化反应完成的酶法是以L-天冬氨酸为底物，经过L-天冬氨酸 -β -脱羧酶的反应，生成 L-丙氨酸1．氨基转移反应氨基转移反应，很早就已为人所知，该反应广泛分布在植物、动物、微生物的代谢过程之中 北井等的研究表明，丙氨酸产生菌胶状棒杆菌(Corynebacterium gelatinosum )No.7183，是通过丙酮酸与L-谷氨酸之间的转氨作用生成丙氨酸的最初由氨基移转反应生成的丙氨酸是L- 丙氨酸， 但是经丙氨酸消旋酶的作用，转变成 D-丙氨酸， 因此该菌株生成的最终产物是DL- 丙氨酸。
2．还原氨基化反应Wiame和Goldmann分别报导了枯草杆菌、肺结核小杆菌(Myeobacterium tuberculosis)有还原氨基化反应鲛岛等在假单胞菌No.483的无细胞抽出液中，检出了丙氨酸脱氢酶活性，该酶以 NAD 为辅酶，最适 pH为9.8 但是还原氨基化反应的氢并不是由乳酸脱氢酶反应提供，而是由丙糖磷酸脱氢酶反应供给该菌株生产的丙氨酸是L-丙氨酸3．天冬氨酸 -β -脱羧酶反应由于大多数采用直接发酵法生产的丙氨酸是DL- 型，而L-天冬氨酸可通过酶法由反丁烯二酸廉价生产， 因此，可采用天冬氨酸为原料，利用天冬氨酸 -β -脱羧酶催化L-天冬氨酸 -β -羧基的裂解来生产L-丙氨酸 Chibata 等发现德阿昆哈假单孢菌（Pseudomonas dacunhae）具有很高的天冬氨酸-β -脱羧酶活性 L-丙氨酸可由L-天冬氨酸化学定量地酶法生产，100g L-天冬氨酸可生成66g L-丙氨酸，其摩尔转化率为99%Takamatsu等和 Tosa等采用共同固定化大肠杆菌（天冬氨酸酶） 和德德阿昆哈假单孢菌（天冬氨酸 -β -脱羧酶），由反丁烯二酸直接酶法生产L-丙氨酸。
目前主要采用酶法来生产L- 丙氨酸第二节脯氨酸发酵L-脯氨酸 (L-Proline ，L-Pro) 是非必需氨基酸，具有特殊甜味，用于制作医药品、配制氨基酸输液、抗高血压药物甲巯丙脯氨酸等工业制造L-脯氨酸，最早是用动物胶水解提取的 1965 年前后，吉永、大和谷、千畑、野口等相继报导了L-脯氨酸的发酵生产法发酵法主要采用谷氨酸产生菌的突变株，近来已引入基因工程技术，用非谷氨酸产生菌由糖质原料发酵生产L-脯氨酸第十五章丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和组氨酸发酵- 2 - 一、脯氨酸生物合成途径及调节机制在微生物中， L-脯氨酸的生物合成是由谷氨酸经过四步反应而生成的，其合成途径如下：谷氨酸 →γ -谷氨酰磷酸 →L -谷氨酸 -γ -半醛 →Δ′-吡哆啉 -5-羧酸 →L -脯氨酸上述四步反应中有三步反应是由酶催化进行的但其中Δ′-吡哆啉 -5-羧酸的合成是自发进行的据对黄色短杆菌No.14-5 （异亮氨酸缺陷）代谢的研究，该菌株主要按上述途径合成L-脯氨酸， 几乎没有鸟氨酸合成的乙酰化途径，也就是说几乎没有鸟氨酸-酮酸转氨酶的反应l967年，吉永等指出 ATP及Mg2＋能够促进黄色短杆菌No.14-5由L-谷氨酸生成 L-脯氨酸， 而且谷氨酸的磷酸化（活化）反应参与了脯氨酸的生物合成。
还指出，No.14-5菌株的异亮氨酸缺陷突变的遗传变异部位是苏氨酸脱水酶的缺失，而且证明， 恰恰是由于这种苏氨酸脱水酶的缺失才引起了脯氨酸的大量积累因为菌体内苏氨酸脱水酶的缺失，而随着苏氨酸的积累，与赖氨酸一起协同反馈抑制了天冬氨酸激酶的活性，从而使ATP剩余同时，由于苏氨酸的增多，也抑制了高丝氨酸激酶的活性，同样也使ATP剩余上述两项ATP剩余，使以 ATP为辅酶的谷氨酸激酶反应容易进行而且作为谷氨酸激酶底物的谷氨酸，也因高浓度生物素存在，在菌体内异常地增加，也有利于该酶反应的进行，从而导致谷氨酸向脯氨酸转变也就是说，产生菌是通过把难以透过的谷氨酸转换为容易透过的脯氨酸的方式，完成了菌体内大量谷氨酸的解毒，于是L-脯氨酸大量积累二、脯氨酸发酵脯氨酸发酵所用菌株大体分为两类，即从谷氨酸产生菌诱导而来的和由非谷氨酸产生菌诱导来的，见表l5-1从脯氨酸发酵产生菌的遗传特性来看，有异亮氨酸缺陷（Ile－） 、组氨酸缺陷（ His－） 、鸟氨酸缺陷（Orn－） 、丝氨酸缺陷（ Ser－） 、苯丙氨酸缺陷（Phe－） 、酪氨酸缺陷（ Tyr－） 、核酸碱基缺陷等；还有磺胺胍抗性（SG r） 、青霉素抗性（Penr） 、利福平抗性（Rifr） 、DL-3,4- 脱氢脯氨酸抗性（DHPr）等。
非谷氨酸产生菌链式寇氏杆菌(Kurthia catenaforma) No.45（L-Ser－） ，是典型的来自非谷氨酸产生菌的脯氨酸产生菌，而且原始菌株也有相当高的脯氨酸产率表 15-1 L-脯氨酸产生菌菌株遗传标记底物L-Pro（g· L－1）黄色短杆菌 2247-№10-5 短杆菌 No.7996-YS-48 链式寇氏杆菌 No.45 谷氨酸棒杆菌 R412 黄色短杆菌 AJ11226 黄色短杆菌 No.199 北京棒杆菌 ASl.727 谷氨酸棒杆菌嗜乙酰乙酸棒杆菌ZQ-3 粘质赛氏棒杆菌SPl87 嗜乙酰乙酸棒杆菌TA-20 大肠杆菌 PYl350 导入株Ile－His－Ser－核酸碱基缺陷Ile－、DHPrIle－、SGr、DHPrOrn－SGr、DHPrSGr、Sucg、DHPrDHPr，TACr、AZCr GlugAZCr、Kmr葡萄糖葡萄糖葡萄糖、天冬氨酸废糖蜜葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖蔗糖葡萄糖、谷氨酸蔗糖12 25 29 30 36.2 45 25～27 30～33 53～55 56 108.3 75 注： Ile 异亮氨酸， His 组氨酸， Pro 脯氨酸， Ser 丝氨酸， Orn 鸟氨酸， Glu 谷氨酸， SG 磺胺孤， Suc琥珀酸， DHP DL-3,4- 脱氢脯氨酸， AZC 铃兰氨酸， TAC 噻唑烷 -4-羧酸， Km 卡那霉素，－营养缺陷，g生长， r 抗性第十五章丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和组氨酸发酵- 3 - 用L-谷氨酸产生菌突变株发酵生产L-脯氨酸， 培养基都是在L-谷氨酸发酵的基本培养基中，添加高浓度的(NH4)2SO4、充分生长所需要的生物素及所需氨基酸或营养物质（按限制 生长的浓度） 。
Nakamori 等将黄色短杆菌2247 的异亮氨酸缺陷菌株，用亚硝基胍（NTG）处理后，获 得的变异株No.199， 在以 10％葡萄糖为碳源的培养基中，培养 72h， 可生成 L-脯氨酸 45g/L 此变异株的胞内ATP 较亲株高1.6～2.0 倍方佩静等在选育产L-脯氨酸的变异株中， 由北京棒杆菌ASl.299 诱变获得一株鸟氨酸缺陷变异株 AS l.727 在适宜条件下，该突变株可产L-脯氨酸 25～27g/L郭慧珍等以谷氨酸棒状杆菌No.94 为出发菌株，经诱变后获得磺胺胍和DL-3,4- 脱氢脯氨酸双重抗性变异株 该菌株产酸率随着生物素的增加而增加，当生物素浓度达300μg/L时，产酸最高最佳发酵培养基为葡萄糖18%，氯化铵6％，生物素300μg/L该菌在5000L 发酵罐中连续发酵6 罐，产 L-脯氨酸 30～33g/L ，对糖转化率为20%，提取收得率为44.4%张伟国等以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCCl3870 为出发菌株，经硫酸二乙酯（DES）和 NTG逐级诱变处理，药物平板定向筛选，获得l 株 L-脯氨酸产生菌ZQ-3(SGr、Sucg、DHPr)，在含 16％葡萄糖的发酵培养基中，可产L-脯氨酸 53～55g/L。
Sugiura等由粘质赛氏杆菌选育具有DHP 和 TAC 双重抗性变异株SPl26，可产 L-脯氨酸20g/L继续以 SPl26为出发菌株， 用NTG(250μ g/mL ，30℃)处理 15min，获得铃兰氨酸抗性变异株 SPl87，在含 15％蔗糖的培养基中产酸40g/L ，当糖浓度增至20％时，产酸高达56g/L中西等以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870 为出发菌株，用NTG 进行诱变处理，在含有2%谷氨酸钠的培养基上进行筛选，获得一株在添加L- 谷氨酸后高产 L- 脯氨酸菌株 TA-20该菌株以葡萄糖为碳源时，在添加6%L-谷氨酸和 2.5%硫酸铵的发酵培养基中，发酵42h，可积累L-脯氨酸 108.3g/L，而副生的其他氨基酸只有0.7g/L 在L-脯氨酸发酵产生菌育种工作中，引入基因工程操作，主要是使从脯氨酸前体物谷氨酸到脯氨酸合成的酶系，或者说是使参与谷氨酸供给的酶增强，从而提高脯氨酸产量伊藤等对乳糖发酵短杆菌缺失磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的谷氨酸缺陷突变株，进行基因操作即以谷氨酸缺陷型的回复作为指标，把参与TCA 循环草酰乙酸供给的PEPC基因克隆，得到重组质粒pAJ200，又使 pAJ200自然发生缺失，获得了稳定的重组质粒pAJ201，然后将其导入乳糖发酵短杆菌的脯氨酸产生菌。
结果PEPC活性提高 1.5倍，使脯氨酸产量提高71%第三节谷氨酰胺发酵谷氨酰胺 (L-Glutamine ，L-Gln) 是一种特殊的氨基酸，为快速繁殖细胞优先选择的呼吸燃料，如粘膜细胞和淋巴细胞；调节酸碱平衡；组织间的氮载体；核酸、核苷酸、氨基糖和蛋白质的重要前体大量的证据表明，谷氨酰胺是一种条件性必需氨基酸在应急情况下，机体对谷氨酰胺的需要超过其合成能力因此，可以通过肠外营养或饲料中添加谷氨酰胺以营养凋控的方式加速动物体的康复谷氨酰胺也是一种极有发展前途的新药作为药物， 有增进脑神经机能的作用，可以用来治疗神经衰弱，改善脑出血后的记忆障碍，促进智力低下儿童的智力发育，防治癫痫病发作，治疗帕金森氏综合症谷氨酰胺也是治疗胃溃疡、慢性胃炎的有效药物一、谷氨酰胺生物合成途径及调节机制第十五章丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和组氨酸发酵- 4 - L-谷氨酰胺生物合成途径与调节机制如图15-1 所示1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，（2）丙酮酸激酶，（3）丙酮酸脱氢酶，（4）异柠檬酸脱氢酶， （5）谷氨酸脱氢酶， （6）谷氨酰胺合成酶图15-1 L- 谷氨酰胺生物合成途径与调节机制以葡萄糖为原料生物合成L- 谷氨酰胺涉及到糖酵解途径（EMP） 、 磷酸戊糖途径 （HMP ） 、三羧酸循环（ TCA 循环）、乙醛酸循环、伍德-沃克曼反应（Wood-Werkman reaction ） ，以及谷氨酰胺合成水平和分支氨基酸合成水平的调控。
葡萄糖 →丙酮酸 →α -酮戊二酸 →谷氨酰胺是谷氨酰胺的主流代谢因此选育谷氨酰胺高产菌株的基本思路为：强化葡萄糖→丙酮酸→α -酮戊二酸 →谷氨酸 →L -谷氨酰胺的代谢主流，减弱向天冬氨酸、缬氨酸、丙氨酸分支代谢流的强度谷氨酰胺产生菌合成谷氨酰胺的主流代谢中，有几个关键酶控制其强度，这几个酶分别受不同代谢物的反馈调节，活化这些酶有利于谷氨酰胺的生物合成1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它是该反应中介于合成与分解代谢的无定向途径上的第一个酶，它受天冬氨酸的反馈抑制；（2）丙酮酸激酶，它是一个别构酶，受乙酰CoA、丙氨酸、 ATP 的反馈抑制；（3）丙酮酸脱氢酶，该酶是催化不可逆反应的酶，受乙酰CoA、NAD(P)H 、GTP 的反馈抑制；（4）异柠檬酸脱氢酶，该酶受ADP 和 NAD(P)H 的反馈抑制；（5）谷氨酸脱氢酶，该酶受谷氨酸的反馈抑制和反馈阻遏；（6）谷氨酰胺合成酶谷氨酸脱氢。