实验技术：组织切片的制备点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润 仅供参考，谢绝转载，否则责任自负组织切片的制备二）切片方法-细节注意1 切片方法的选择光镜和免疫组化研究的切片一般为5pm,而神经组织切片为20-100pm,有利于 追踪神经纤维的走行1.1 冰冻切片 是免疫组织化学中最常用的一种切片方法,能够最大量的保存抗原、操作简便, 主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分）,但标本来源受限 冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位冰晶小而多，对组织结构损 害大因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33〜-43°C的 时间具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入 小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可 达-70°C用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰 丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70C时即可使用将组织（约 1cmx0.8cmx0.5cm） t投入异戊烷内速冻30-60S后取出，置-80C低温保存或置 恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直 径约2cm）,如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓 平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。
此时小盒保 持原位切勿浸入液氮中，大约10-20S组织即迅速冰结成块取出组织块后立即 置入-80C冰箱贮存或作恒冷切片②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3 天, 利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量冰冻切片一般用恒冷切片机切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于 低温冰箱内， 进行短暂预固定干燥后贮存于低温目的】组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下 进行临床诊断和科学研究原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为 H & E 染色苏木 素是碱性染色，细胞核被染成深紫或兰色，常用作核染色；伊红是酸性染色，细 胞浆染呈红色，常用作胞浆染色材料】1. 试剂和溶液1）2-甲基丁醇（异戊醇）（2）干冰（3）O.C.T.（Tissue-Tek, SAKURA）（4）冰冻或石蜡组织块（5）酸性 Harris 苏木素染料（6）1％酸性酒精70％酒精 99 ml浓盐酸 1 ml（7）醇溶性伊红染料（8）酒精（9）二甲苯（10）树脂封片液2. 设备（1）塑料模具（2）长镊子（3） Superfrost Plus 玻片（Fisher Scientific）（ 4）盖玻片（5）刀片（一次性或非 一次性）；（6）冰冻或石蜡切片机（Leica , Micorm或其它）方法】方法 1、冰冻切片的制备一、准备冰冻组织1. 用塑料或不锈钢容器盛上 2-甲基丁醇（异戊醇），然后不时放入小块干 冰，使温度降至-40°C到-50°C,并保持低温。
2. 标记塑料模具并将O.C.T灌入模具，覆盖其底部3. 收集组织标本快速，轻柔和准确地取材以保证组织标本的质量，是获 得高质量免疫标记染色的最基本条件4. 将取下的组织标本置入灌有O.C.T的模具，用O.C.T灌满模具，直至标 本完全被其覆盖组织标本应尽量贴近模具底部，使标本在切片时易于暴露酌 情调整组织标本的位置用长镊子挟住模具，放入冷却了的 2-甲基丁醇（异戊醇） 溶液中为了避免产生空泡，先将模具底部触及溶液，盛有标本的模具从底部 开始向表面冷冻，然后将整个模具放入溶液中 5-10分钟1） 多数取下的组织标本可以直接放入模具如标本沾有大量液体，应当 用吸水性能好的纸沾去多余的液体，然后冷冻包埋不要用溶液清洗标本2） 需要先固定处理的组织标本，可以在完成固定后，用 10％到 30％蔗 糖-缓冲液处理，再冷冻包埋5. 将冻好的组织标本保存在-80°C冰箱以待使用二、制作冰冻切片1. 切片前先将冰冻组织标本从-80°C冰箱里取出，放在冰冻切片机（-20°C） 内复温2. 用O.C.T•将冰冻组织块冻在冰冻标本盘上，然后将其固定在切片机上 调整好组织块平面与刀片的位置后，开始切片直至切到预想的部位后，开始收 集切片。
根据研究目的的不同，切片可选择不同的厚度3-6 Pm是常用的切片 厚度，也可以是25-50 Pm厚3. 切片在室温下晾干，然后用理想的固定液固定如果选用冷丙酮或丙酮/ 甲醇，切片在经过 20 分钟固定，并在室温下晾干后，可以直接用于染色，或者 将其放在密封的切片盒并存入-80° C冰箱，以待使用4. 余下的冰冻组织块，可用O.C.T•覆盖其暴露面，然后存入-80°C冰箱以 待下次使用方法 2、石蜡切片的制备1．收集组织标本并将其固定10％福尔马林缓冲液是最常用固定液，也可 根据实验的需要选用其它固定液根据标本的大小，将其在室温下固定8-24小 时，或更长标本的厚度以不超过3 mm 最佳完成固定后，标本即可进行下一 步的处理2．制作石蜡组织块需要专用的设备，以及复杂的组织处理过程通常由组 织学或病理学实验室完成3. 石蜡切片准备好盛有40°C蒸馏水的水浴箱，把包有组织的石蜡块固定 在石蜡切片机上，根据需要切成一定的厚度（常用4-6 ”m），将切片浮在水浴箱 的水面上，再转到Superfrost Plus片子上切片在室温下自然风干过夜，贮存 待用冰冻切片§§§§§§ （一）冷冻切片的种类冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。
这些方法，随着时*代的变迁，科技的发展，许多年前被 认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了当然有些技术，如低温恒冷箱冰 冻切片法，正在受到青睐二）冷冻切片的目的 （1）在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合， 或者怀疑时，需要病理确定2）了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否 需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施3）对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切 缘是否有残存的肿瘤组织4）在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织5）显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些 科研组织等6）某些酶的显示如 ATP 酶，琥珀酸脱氢酶等7） 神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal 氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等8） 对某些物质所进行的免疫荧光的研究三）冷冻切片的制作方法（1）低温恒冷箱冷冻切片制作法1. Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能该机的箱面上有电子控 制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并 可持续10mi ns。
启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉， 并可持续15mi ns有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组 织的冰冻状况配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该 键，可对工作间进行消毒当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间除 此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键， 还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60°C左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工 作间的温度在0-30C间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来2．操作方法及步骤：① 取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整， 最好为 24x24x2mm0② 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放 上细小组织，滴上包埋剂0③ 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组 织修平0④ 调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细 胞稀的可稍为厚切，一般在5〜10um间⑤ 调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要 细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置0切片时，切出的切片能在第一时 间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上0这时便可掀起防 卷板，取一载玻片，将其附贴上即可0⑥ 应视不同的组织选择不同的冷冻度冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的 组织而定，不能一概而论0如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻 箱中的温度不能调太低，在-10--15°C左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织 时，可调在-15〜20C左右，切带脂肪的组织时，应调至-25C左右，切含大量 的脂肪时，应调至-30C3．冰冻切片时的注意事项：① 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和 用柔软的纸张擦0有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次0因为这个地方是切 片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切 片，便切片不能完整切出0② 多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱0③ 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓'砍柴看柴势〃，切片也 是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
④ 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不 能使用临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了 的组织，反而增加了切片的难度如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会 出现冰晶这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到 组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶⑤ 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温 停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化 组织，再行切片另者，调高冰冻点⑥ 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可因为当附贴切 片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载 玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起 时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一 起如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象 4．冰冻切片的快速染色法 冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色 以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。
根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性， 核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物 质冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切 片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000 例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其 他物质都完好保存方法：1. 切片固定 30 秒－1 分钟2. 水洗3. 染苏木素 3－5 分钟4. 分化5. 于碱水中返蓝 20 秒6. 伊红染色 10－20 秒7. 脱水，透明，中性树胶封固冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟总共在10 分 钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下冰冻切片的。