烟草基因组中NBS类抗性基 因的分析专 业 作 物 学答 辩 人 冷 晓 东指导教师 樊龙江教授综 述• 烟草是一种重要的经济作物，烟草行业一方面能够为国家 增加税收，同时对发展国民经济和满足人民生活需要，都 起了重大的作用 • 烟草作为模式植物，对于植物科学发展来说，无论是在基 础研究还是在应用方面都起了很大作用，尤其是在遗传、 育种、生理、生化以及采收后代谢方面 • 烟草也是研究植物病原互作最好的模式作物之一抗性基 因在植物与病原互作过程中，起到非常重要的作用所以 对抗性基因的研究，无论对植物本身，还是对指导育种都 有非常重要的意义 • 在烟草基因组测序的背景下，我们对烟草抗性基因进行了 一些基础性的研究研究过程烟草基因组的分析 (基于TGI基因组序列) NBS类抗性基因的生物信息学分析 烟草NBS类抗性基因遗传多态性分析NBS类抗性 与抗性基因连锁的基因家族分析 SSR分子标记的开发 关于TGI（Tobacco Genome Initiativehttp://tgi.ncsu.edu/）数据类型条数/平均长度累计长度（Mb）占基因组比例经甲基化筛选的克 隆序列1,082,523(5 files)682.2bp 738.5 16.4％未经筛选的克隆序 列 16885+25023 =41908 746.2+682.3bp12.6+17.1=29.7 0.7%BAC克隆末端序列1628360.7bp0.587BAC序列140,156(93 BACs)726.9bp 101.9 2.3％合计 1,266,215 870.7 19.3％拼接去冗余后信息数据类型序列条数/平均长度数量（Mb ）占基因组 比例覆盖功能基因（ 比例） 108.7kb per BAC10.0Mb0.2％ / /合计 494054 <491.2Mb <10.9% <2408(<18.2%)所有数据来源基因组序列：TGI EST序列：TGIGenebankESTobacco (European Sequencing of TobaccoProject http://www.estobacco.info/)TAB (Transcriptome Analysis of BY-2，http://mrg.psc.riken.go.jp/strc/)RGA（ Reistance gene analogue）的背景介绍IIIIIIIVVPKNBSLRRLZ/CCTIRTMPKPtoMi/PrfXa21Cf4/Cf9NNBSLRRLRRLRRTMRepresentative gene分析流程已知的NBS抗 性基因同源 序列 搜索清理 拼接基因 预测蛋白 预测寻找 结构 域系统 发育 树已知的NBS类抗性基因ClassmotifR genePlantPathigenAvr geneAccessionLZ-NBS-LRRCC NB-ARC LRR5RPS2Arabidopsis thalianaPseudomonas syringae pv.tomato B: NBS173; C: NBS271; D: NBS374; E: Nbs359; F: NBS182; G: NBS334; H: NBS2672 进化分析进一步对RGA亚家族选择进化进行分析。
RGA 基因进化历程可能是处于一种中性随机突变状况 （M1a和M7模型）或受到正向或负向（又称净化） 的选择（M2a和M8模型）根据Yang等（2005）方 法(Yang et al., 2005)，我们可以估计烟草RGA 基因亚家族成员的序列构成符合哪个进化模式 结果表明 在测验的8个RGA基因中，大多受到强烈 的净化选择，同时部分基因在其个别位点上受到 明显的正向选择烟草RGA基因亚家族进化选择测验（似然比）结果考虑到测序等误差，所选用的每个RGA亚家族成员间序列差异度≥1% (Couch et al., 2006)烟草基因组RGA基因的系统进化关系通过PCR产物直接测序和克隆测序，共获得426条特异RGA基因序列 ，包括来自栽培烟草11个RGA家族的293条基因序列和19条野生烟草的 基因序列经注释，除了部分由于移码、终止子等导致的假基因，其 中绝大多数序列可以获得完整的NBS蛋白质序列为了确定这些基因 序列的系统进化关系和亚家族归属，我们对获得的所有序列和已知烟 草和其他主要类型抗性基因进行了系统进化分析从系统进化树可以 看出，我们鉴定的烟草RGA几乎覆盖了所以类型的已知抗性类型，包 括TIR-NBS类和大量非TIR-NBS类基因。
非TIR-NBS类基因中，烟草中 一个烟草亚家族（I2，红色部分）已进行一定数量的测序调查(Couch et al., 2006)，我们获得的数据也同样包含了这类RGA基因序列同 时，与已知抗性基因有较大差异的一批烟草RGA被发现，这部分RGA基 因表现出烟草RGA的特异性，其中部分可能是烟草特有的RGA基于RGA蛋白质序列和临接法（NJ）构建的烟草RGA基因系统进化树图中包括本研究获得的烟草NBS类抗性基因（黑色）、GeneBank数据 库中已有烟草RGA基因序列（红色）和目前已克隆抗性基因（其他颜色 ） 烟草RGA类抗性基因SSR分子标记开发• 前期对烟草RGA基因进行了基因组分析，发现了一 大批烟草RGA基因，遗传多态性分析结果表明，烟 草RGA基因存在高度的遗传同质化，这给发现与抗 性相关RGA增加了难度• 为了探索获得与抗性相关RGA或相应标记的高效途 径，本研究利用烟草基因组序列开发了与RGA紧密 连锁的SSR标记分子标记开发流程在基因组中查 找含有RGA区段 的序列在其上下游 寻找SSR序列设计引物23个烟草材料中进 行PCR扩增用于开发烟草SSR标记的23个栽培烟草品种及 其野生种基本信息序号品种名称类类型抗性原产产地 黑青根CMV蚜1小黄金1025烤烟山东 2红花大金元烤烟---++++---云南 3K326烤烟---++--++美国 4Hicks Broad Leaf烤烟-----美国 5301雪茄+--美国 6 （沙姆逊）白肋---阿尔 巴尼亚 7burley 21 （白肋 21）白肋------德国8TN86白肋-美国 9土耳其巴斯玛香料土耳其 10N.undulata野生秘鲁 11N.glutinosa野生-++--秘鲁 12N.sylvestris野生--阿根廷 13N.repanda野生--+墨西哥 14N.plumbaginifolia野生+---阿根廷 15Ambalema晒烟---++----美国 16TI 晒烟++-–----国外 17Beinhart 1000-1雪茄+---美国 18长脖黄烤烟-------+河南 19斯佩特 基-28烤烟++------美国 20云烟87烤烟--++++云南 21Coker 176烤烟++++++-----美国 22C151烤烟O广东 23NC82烤烟--------美国注：黑：黑茎病；青：青枯病；根：根结线虫病；CMV:烟草花叶病毒病；蚜：烟蚜；-：感病；--：中感；---：高感。
抗病；++：中抗O：耐病开发烟草中与RGA相关的SSR标记设计的引物引物名称正向引物（FWD_PRIMER）反向引物（REV_PRIMER）重复基元目的片段（bp）退火温度（℃） TSN1001GGCCTGCATGAATAAAAGAAAGAACCTCCCATGAAGATTGTATGAACAGA15855 TSN1002CAGAGGTTAAACCAACCCAAAATCACCCATGGAGGAATGGCTAGTAG16055 TSN1003ATTGTTTTCACCCATGGAGGATTAGTCTGACGATCACTGAAAACACGTC13655 TSN1004GTCCAATTAGAGGGGAGGGAACTACCTCCAGTGTCAACATCATCTACGGAA15355 TSN1005CTAGACGGCACGACACTGTGTTAACAAACTCGATTCAGAACATGCAACTAT14855 TSN1006CTGGCTTACCTCCATGAAGATTGTGCCTGCATGAATAAAGCAAGAAATCT13455 TSN1007TCTTCCAAAAAGAGTACGCAATCACAGATGTTCAAACAAATACAGATGTCGAAT15355 TSN1008GTGCGTAAGAAGTTGAGCTTACCCAGTTTTCTGGCATATGAGGAGGTGTA13655 TSN1009ATCTCTCCTGTCAAGTGTGGGAAATCTTCGAGACCTGCACTTAGAAGGAG14555 TSN1010CGGGTACATTTTCTTGATTCAACTGCAACAAAATAGATAACTTACCACGTCAT23055 TSN1011TTAAAATGTTGTTTCCTCATGATTTTTTTTTAAACACAAGACAATTGTACCCAAG14755 TSN1012CAGCACAACGAAGATGAAGAAAATTTTGGGGAGTTTTATTTTATAAGGGATA15955 TSN1013TTAACTGCTCGTCTCGTCAGTTTGTTCCTTATGCCACGTCACCTCTATTC14855 TSN1014CATCACTATTTATCAAGTTAAACCGGAACTTGTGTCCAAGTGGTGTAGTTTAGTTAT15855 TSN1015AGTAGGTTTGTGTACAACTGTCAATAGCATCGAATACCGAAGTACCAAATCATA15955 TSN1016GCATCCTCTCAAGCCCTTTTTAATGGTTTGGTTTTGTCCATGAGTAGGTC13055 TSN1017TTTCAAATAGCAGTAGCATTTCATCATGTCCAAACAACATTCATTTTATTCATCT14355 TSN1018CCCCAAACCCCTAAAACCCTGGTTTCGGGTTTCGGGTTACAAACCCG20155 TSN1019AACACTGAGTCCATGTCATCATCATTCCCCTATCATTCAAGACTTCGTTCT15155 TSN1020ACTAGTTGTGTGAAGGGGATGTGATTCTGAAGGTCAAGGGCTAGATTGAGA12255 TSN1021AGGTCTAGCTCAGAATGCACAATGAATCATATACACACATGGCACAGGAAT13155 TSN1022TAAGAAAGAAGACAACGACGACGACGGAGTAGGGGCAAGATCTATGTAACA11555 TSN1023CTTTTGGGCTCTCTTCTCTCATTGCACATAAGCTCATTGGATTTGCAGTTC13755 TSN1024GTTTTTGGTGAGGTGCTTTCAGATCCAATTCCAACATCATCACATAATAAAGT14755 TSN1025CATGGACCAAGTAAATCACTGTCGTCAACAATGCTTTTCGATTCATTCCT15955 TSN1026CCAATGGACTTCAACATAAAGCAAGTGAAAGTCCCATTTGGATCTTCTTGA10955 TSN1027TAAGGTCAATGGTTAAAGCGTCGTTAAACC。