转膜和抗体孵育在 transbuffer 溶液中进行：如图将滤纸和膜，胶重叠好注意赶走气泡！！！！！！！负极胶滤纸 膜正极向转膜槽中加入 transbuffer,将槽置于冰中进行转膜， 100v，1 小时将裁好的与凝胶尺寸相当的 PVDF 膜先用甲醇浸透活化 1 分钟PVDF 浸泡在转移缓冲液中 15 分钟，裁剪 6 张尺寸一致的滤纸一起置于转移缓冲液中浸泡转膜结束后，将 PVDF 膜放入 9cm 平皿中加入足量封闭液完全浸泡膜，室温平摇 1 小时PVDF 用 ddH2O 漂洗 5 分钟，准备：PVDF，滤纸，甲醇，去离子水，9cm 大板（甲醇活化一个，水洗一个， ）转移缓冲液 transbuffer，封闭液，TBST, 一抗（稀释 1000 倍） ，二抗（稀释 5000 倍） 电泳后的凝胶放入转移缓冲液中不超过 30 分钟稀释抗体 1000 倍（3 微升一抗加 3 毫升水） 准备好含一抗的封闭液和膜放入杂交袋中封好放置到静止混合器上摇 1 小时将膜取出浸入 TBST 缓冲液，平摇洗膜三次，每次 5 分钟将膜取出浸入 TBST 缓冲液，平摇洗膜三次，每次 5 分钟准备好含二抗的封闭液{在封闭液中按 1:5000（10ml 封闭液中加入 2ul 二抗）比例加入碱性磷酸酶标记的二抗,（1:10000—1:20000 比例加入辣根过氧化物酶标记的二抗）}和膜放入杂交袋中封好。
放置到静止混合器上摇 1 小时显色液摇动显色，准备 ddH20 终止显色20s左右，即可显色。