紫球藻生长周期可见光吸收光谱与生化变化*王明兹 施巧琴 陈必链 庄惠如 吴松刚(福建师范大学生物工程学院, 福州, 350007)摘 要 测定紫球藻生长周期中活细胞可见光吸收光谱和代谢产物变化结果表明, 存在波长为430~ 445nm、 555~ 565nm 和 680~ 685nm 3 个较大吸收峰, 还存在 500~ 510nm 和 620~ 630nm 2个次吸收峰且波长为 440、 560 和 680nm 时的光吸收值与细胞数成正比增长, 可用于快速测定紫球藻培养液的细胞浓度关键词 紫球藻, 生长周期, 吸收光谱, 细胞浓度, 生化组成第一作者: 硕士, 讲师 * 福建省教育厅资助项目( No. JA010160) 和福建省计委资助项目( No. 1996 050)收稿时间: 2002- 08- 26, 改回时间: 2003- 02微藻具有高蛋白、 低脂肪, 及富含多种对人体健康有特殊保健和调节功能的生理活性物质等特点, 倍受人们关注微藻开发与生 产正成为一个新的产业, 但当前微藻生产中存在许多缺陷, 如产品单一, 只有螺旋藻、 小球藻和盐藻等少数几个生产种类, 培养方式 较为粗放, 产品加工深度也不够, 制约了产业升级和规模扩大。
紫球藻是一种单细胞红藻, 能合成大量 的紫球藻多糖、 藻胆蛋白、 多不饱和脂肪酸等高价值生物活性物质[1]它的细胞呈球形, 胞外包围着一层由胞外水溶性粘多糖) )) 紫球藻多糖构成的粘质鞘( gelatinous sheaths) ,该多糖可作为胶体稳定剂、 食品增稠剂, 还具 有抗病毒、 降血脂、 降胆固醇、 预防癌症等活性细胞色素除含叶绿素、 胡萝卜素和叶黄素外, 还有一个大而呈星状的载色体, 含有大 量藻红蛋白、 藻蓝蛋白, 其中以 B -藻红蛋白( B -PE) 最为丰 富, 载色体 因此而 呈深红色[ 2]紫球藻所含的多不饱和脂肪酸, 以二 十碳五烯酸( EPA) 和花生四烯酸( AA) 为主,可以调节细胞构型、 动态平衡、 相转变, 细胞膜的渗透性以及与膜有关的生理过程, 具有 抗血栓、 降血脂、 降血压、 减缓动脉粥样硬化等比较广泛的生理活性[ 3]近年来, 紫球藻的培养与应用研究也逐渐成为热点, 前人已就该藻培养过程中的生长周期及细胞壁合成有所探索[4]温少红 等研究了它的藻红蛋白光谱特性[ 5]活细胞对可见光的吸收光谱和生化组成有密切关系, 特别是与所含的色素种类和数量有关, 不 同培养条件和营养盐, 以及重金属等都对色素和色素前体的合成与转化有影响, 尤其是光照强度等影响最为明显[6,7]。
紫球藻在生 长后期能合成大量的胞外多糖, 同时细胞聚集成团, 细胞计数法测定生物量不但操作繁琐, 而且由于大量细胞结团也难以准确计数 本文通过研究其生长周期中细胞的可见光的吸收光谱变化, 了解该藻生长周期中的生化组成, 特别是色素的变化规律, 期望建立一种 快速测定紫球培养液中生物量的方法, 为其培养、 测定和采收提供科学依据1 材料与方法111 藻 种紫球藻( Porphyridium cruentum ) 藻种 引自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库, 经平板分离复壮112 培养基 KOCH 培养基[ 8]113 培养条件以日光灯为光源, 12B12h 光暗周期, 光23第 29 卷 第 4 期 王明兹等: 紫球藻生长周期可见光吸收光谱与生化变化研 究 报 告强度为 1 600~ 3 000 1x, 培养温度为( 25 ? 1) e , 用 250mL 三角瓶装 100mL 培养液,20% 接种量, 于往复式摇床振荡培养, 振荡频率为 90r/ min114 可见光吸收光谱测定 53WB 型紫外 -可见分光光度计( 上海光学仪器厂) 测定波长为 420~ 750 nm 的光吸收值。
115 细胞数血球计数板计数116 叶绿素测定[ 9] 参考Hansmann( 1973) 方法, 稍修改每天定时取样, 3500r/ min 离心 5 min, 弃上清液, 蒸馏水洗涤, 离心后藻细胞沉淀用甲醇抽 提, 混匀, 置于冰箱浸提过夜取出后充分混匀, 离心、 收集上清液, 沉淀再用少量甲醇抽提, 最后将上清液定容至 10mL, 然后测定波长为 665nm 的吸光值 叶绿素浓度( mg/ L) = A665@ 相关系数@ 稀释倍数(紫球藻相关系数为 1312)117 胞外多糖测定 蒽酮比色法[ 10]118 B -胡萝卜素的测定参考刘建国等方法, 加以修改[11]取藻 液10mL, 离心, 弃上清, 沉淀物加入 10 mL质量分数为 80% 的丙酮溶液, 研磨混匀, 离心, 取上清液, 按该法重复提取, 合并所有上 清液, 定容, 测定 450nm 波长处吸光值, 根据如下公式计算: B -胡萝卜素含量( mg/ L) =OD450@ 稀释倍数 @ 10 @ 1000) / 2500( 其中:10 为藻液体积, 1000为单位换算值, 2500为 B -胡萝卜素系数 )2 结果与分析211 紫球藻活细胞可见光吸收光谱紫球藻细胞以二分裂方式繁殖, 在本试验条件下, 倍增时间约为 0199~ 1152d, 接种 2d 可见大量处于分裂的双联细胞, 到第 3 天还可找到四联细胞, 但主要以单个细胞分散悬浮为主, 无聚集成团现象。
0~ 14d 培养液的可见光吸收光谱( 波长为 420~ 750nm) 分别如图 1、 图 2 与图 3 所示图 1~ 图 3 结果表明, 紫球藻活细胞存在波长 430~ 440nm、555~ 565nm 和 675~ 685nm 3个主吸收峰,此外还有 500~ 510 nm 和 620~ 630nm 2 个次吸收峰活细胞吸收光谱是所含的各种色素综合作用的结果, 主要受叶绿素( 包含叶绿素 a、 叶绿素 b 等多种组分, 单独测定时各有多个吸收峰) 、 藻胆蛋白( 包含藻蓝蛋白、 藻红图 1 紫球藻细胞培养液 0~ 3d可见光吸收光蛋白和别藻蓝蛋白等) 、 叶黄素、 胡萝卜素以及其他捕光色素含量变化的影响其中叶绿素 a 主要吸收峰为 430 和 678 nm, 藻红蛋白为 498、 545 和 563 nm 等, 藻蓝蛋白主要在620 nm 一 带, 别 藻 蓝蛋 白 在 680 nm 左右[ 12,13]因此, 紫球藻活细胞吸收光谱中 3个主吸收峰主要是叶绿素 a、 藻红蛋白和别藻蓝蛋白的作用, 而 2 个次吸收峰主要是藻红蛋白和藻蓝蛋白的作用, 很明显, 藻红蛋白和叶绿素 a 是紫球藻细胞光合作用的主要捕光色素。
从图 1 可见, 培养 0~ 3d 内, 紫球藻尚处于适应期, 这时镜检观察发现, 藻细胞逐渐膨大并开始分裂, 培养 2~ 3 d 大多为花生状和哑铃状的两分裂细胞, 此时细胞对可见光吸收比较均衡, 3 个主吸收峰吸收值较为接近, 主要吸收红光、 绿光和蓝紫光图 2和图 3 可见, 4~ 10d 的培养物处于对数生长期, 3个主吸收峰特别明显, 而且每天的吸收值增加均极为显著, 此时吸收蓝紫光和蓝绿24食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vol129 No 14研 究 报 告光为主, 长波长处趋向于集中吸收红光11 ~ 14d 培养液对可见光的光吸收值大小随时间变化较前趋缓, 表明细胞数增殖速度减弱,这阶段也以吸收短波长的蓝紫光为主图 2 4~ 7d 紫球藻培养液可见光吸收光谱图 3 7~ 14d 紫球藻培养液可见光吸收光谱在紫球藻生长周期中, 3 个主吸收峰值 随培养时间规律变化, 主要原因是生长周期中细胞浓度增加后影响可见光在培养液中穿 透和扩散, 细胞为最大化捕光导致所含色素有一定调整, 从吸收光谱图分析, 当藻细胞较 少时, 光照充足, 叶绿素是主要的捕光色素;当藻细胞浓度增加后, 光衰减现象严重, 水体 较深层光线极弱, 细胞仅由叶绿素吸收光能而不能满足细胞代谢的需要, 开始较大量地 合成辅助色素, 辅助吸光以满足光合作用的需要; 到对数晚期, 藻细胞积累代谢产物 )))藻胆蛋白的速率增大, 其中主要为蓝红蛋白, 表现为在 480~ 570nm 波段的蓝光区和 420~ 460nm 蓝紫光区吸收峰显著增强; 到了稳定期, 细胞密度和培养液粘度增大, 只有穿透力强的高能量光才能深入培养液, 透过细胞 粘质鞘而到达光合色素区, 所以此时 420~430nm 波段处吸收峰特别显著, 长波光区就只剩下 680nm 一带的叶绿素 a 吸收峰, 620nm 左右的藻蓝蛋白吸收峰已明显趋弱。
212 藻细胞光吸收值与细胞浓度的关系不同波长处吸光值与紫球藻细胞浓度的关系如图 4 所示从图 4 中可见, 细胞浓度 与可见光吸收值变化规律具有相关性, 在培养周期中, 3 个主吸收峰对应的波长 440、 560和 680nm 所测得的吸光值大小均与紫球藻细胞浓度成正比增加, 可用以表示生长指标图 4 紫球藻生长周期 OD 值和细胞数变化213 紫球藻生长周期主要生化物质变化紫球藻整个生长周期的主要生化组分的含量变化结果如图 5 所示在其早期培养物 中胞外多糖和 B -胡萝卜素合成量较少, 培养后期合成迅速上升叶绿素含量在整个生长周期中平稳递增, 主要与细胞浓度增加有关,单细胞中的含量较为稳定3 小结与讨论紫球藻生长周期中细胞对可见光的吸收 是有选择的, 对不同波长光的吸收受到环境条件和培养时间的影响, 它们作用于细胞内各种色素与色素前体的合成和转化, 其中光照强度的影响最为明显[6]在整个生长周 期中, 紫球藻细胞主要存在 3 个主吸收峰和25第 29 卷 第 4 期 王明兹等: 紫球藻生长周期可见光吸收光谱与生化变化研 究 报 告图 5 紫球藻生长周期代谢产物变化2 个次吸收峰, 细胞内所含的叶绿素 a 和藻 红蛋白是形成 3 个主吸收峰的关键因素, 其中 675~ 680 nm 是叶绿素 a 的特征峰, 如沈萍萍等测定了 15 种微藻细胞的光吸收变化,在 670nm~ 680nm 是它们的共同吸收峰, 是 因为它们均含有叶绿素 a[ 13]。
而 555~ 565nm 是藻红蛋白的特征吸收峰[ 5]不同生长阶段时吸收峰有小幅波动, 可能是细胞浓度 增加引起光衰减, 细胞为了最大化捕获利用有限的光能而对各色素合成有所调整所致在3 个主吸收峰波长 440、 560 和680nm处所测得的培养液吸光值与其中的细胞浓度 均成正比关系, 可用分光光度法快速测定培养液吸光值, 作为可靠的生长指标560nm处于可见光的中段, 此波长时分光光度计工 作稳定, 又是藻红蛋白吸收峰, 而藻红蛋白是紫球藻的特征色素, 用它作为该藻的生长指标十分适宜, 本研究中均采用这一波长紫球藻在培养后期常聚集成团, 采用细胞计数法不但操作繁琐, 工作量大, 还因有团 块而无法计数或波动很大改用光密度法不但快速、 稳定, 而且数据也较为精确可靠致谢: 本院发酵工程专业 2002 届学生陈美香、林清良参与本文实验工作参考文献1 王明兹, 施巧琴, 郑梅清等 1 亚热带植物科学, 2001, 30(2): 66~ 69 2 顾宁琰, 刘宇峰1 中国海洋药物, 2001( 6) : 43~ 48 3 温少红, 王 长海, 鞠 宝等 1 中国海洋药物, 1999170(2): 28- 31 4 Bracha S B, Dudy B Z, Shoshana A1 J1Phycol1, 1999, 35: 78~ 83 5 温少红, 徐春野, 鞠 宝等 1 海洋通报, 2000, 19 (3): 90~ 93 6 Kohata K, Watanabe M1 J1Phycol1, 1989, 25: 377 ~ 385 7 王大志, 王海黎, 李少菁等 1 生态学报, 20( 3): 482~ 484 8 华汝成1 单细胞藻类的培养与利用 1。