第八章第八章 园艺植物基因的分离与克隆园艺植物基因的分离与克隆园艺植物生物技术主要内容第一节 文库筛选法 第二节 图位克隆技术 第三节 转座子标签法 第四节 基因差异表达技术 第五节 同源序列法 第六节 基因芯片技术 第一节 文库筛选法一、园艺植物基因组文库的构建二、园艺植物cDNA文库的构建三、目的基因的筛选 一、园艺植物基因组文库的构建（一）基因文库的定义及类型 l定义 l一组DNA或cDNA序列克隆的集合体 l类型 l基因组文库：来自园艺植物基因组全部DNA片段组成的基因文库，反映基因组的全部遗传信息 lcDNA文库：将某一特定组织表达的mRNA反转录成 cDNA组成的基因文库，每个克隆只含1种mRNA信 息，足够数目克隆则包含细胞全部mRNA信息 lcDNA便于克隆和大量扩增，不像基因组DNA含有内含子很难表达 一、园艺植物基因组文库的构建 （二）构建的植物基因组文库需满足的条件l文库能够覆盖整个基因组 l插入的DNA片断比较大l文库易于保存且较稳定基因组文库构建流程 示意图 一、园艺植物基因组文库的构建（三）载体的制备l完整的基因组文库所需要筛选的重组子数目lN＝ln(1-P)/ln(1-f) 。
lN，重组子的数量；P，所要求的概率；f，某一插入片段与相应生物基因组大小的比值l要以0.99的概率获得番茄基因组（9.5×108bp）20kb的插入片段，所需要筛选的重组子数目为： lN＝ln(1-0.99)/ln[1-(2×104/9.5×108)]=2.2×105 2.载体的选择：a）质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效的范围为20kb3、DNA不完全酶切条件的确定a) 确定限制酶用量，改变酶切时间b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量DNA的不完全酶切相同时间 不同量（三）酶切片段与克隆载体连接１、酶切片段的分离与纯化１）低熔点琼脂糖回收目的片段２）试剂盒回收目的片段10 kb2、酶切片段与克隆载体连接 Ø 连接体系中的四种连接方式：载体自连、载体和基因组DNA片断的连接、基因组DNA片断的自连和基因组片断之间的连接Ø 只有基因组DNA和载体之间的连接才是所需要的如何提高它们之间的连接效率是连接反应的关键Ø 可以通过调整载体与基因组DNA的比例来达到较好的效果需要经过一段时间的摸索基因组DNA片段3’凹端的不完全补平的策略-GATC- -CTAG-- GATC- -CTAG -Sau3AI-GA GATC- -CTAG AG-KlenowdATP /dGTP-CTCGAG- -GAGCTC-XhoIKlenowdCTP /dTTP-CTC TCGAG- -GAGCT CTC-互补GEM-11基因组DNAVector 载体的遗传转化l电转化是转化大肠杆菌使用最普通的一种手段。
l插入片段越大，转化效率越低 克隆的挑取、验证l从文库中随机挑选一定量的克隆，摇菌，提取质粒 DNA，酶切后，脉冲电泳检查插入片段的大小，并根据数目计算空载率 l细胞器DNA的污染会降低文库的实际容载量，一般用线粒体和叶绿体的探针对文库进行检测五）基因组DNA文库克隆子的保存与筛选1、基因组DNA文库的保存1) 影印滤膜保存法2）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长 数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为25%的甘油）缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列 采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都只有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。
可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多二、园艺植物cDNA文库的构建 二、园艺植物cDNA文库的构建 （一）普通cDNA文库的构建 l纯化mRNA样品的制备 l选择特定发育阶段的特定组织为分离mRNA的材料 lmRNA的纯化:利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴与 oligo (dT)互补杂交，使mRNA固定在固相介质上，再 将mRNA洗脱下来，制备出纯化的mRNA样品 lmRNA样品完整性的检测：根据28S和18S rRNA电泳 条带的亮度判断RNA的完整性，从而间接地判断 mRNA的完整性 l如果28S rRNA条带的亮度是18S 的两倍，RNA样品完整； l如果两条带的亮度反过来，说明RNA样品部分降解； l如果无清晰的条带，说明RNA样品已经严重降解 二、园艺植物cDNA文库的构建 （一）普通cDNA文库的构建lcDNA第一链的合成 l关键是获得大量完整的cDNA拷贝l影响因素：模板mRNA的质量、反转录酶、引物l反转录酶：禽源 (AMV)和鼠源反转录酶(M-MuLV)l AMV：除具有DNA聚合酶活性外，还有很强的RNase H酶活性。
lM-MuLV ：RNase H活性比AMV低，但反转录效率比AMV低 lSuperscript反转录酶：除去了MMLV的RNase H活性，更能保证cDNA第一链的全长和高产l引物常用oligo (dT)和随机六聚体核苷酸 mRNAcDNA第一链的合成 5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH 3’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs二、园艺植物cDNA文库的构建 （一）普通cDNA文库的构建l双链cDNA的合成 l自身引导合成法 l利用新合成的单链cDNA 3’末端反转所形成的发夹环的双链部分作为引物，引导DNA聚合酶以cDNA为模板，合成互补的第二链cDNA，反应结束后，用S1核酸酶降解发夹环的单链部分，即可得到双链的cDNA片段 l主要缺点是在用S1核酸酶去除发夹环时的反应条件要求极为苛刻，难以控制，目前已极少采用 自身引导法合成cDNA第二链的技术流程 二、园艺植物cDNA文库的构建 （一）普通cDNA文库的构建 l双链cDNA的合成 l置换合成法 l利用RNase H将杂交双链中的mRNA降解，形成多段仍与cDNA 第一链保持杂交的RNA片段。
l利用这些RNA片段作为引物，引导合成第二链cDNA l随着合成产物的延伸，除5’末端的RNA引物外，所有作为引物 的RNA片段均被新合成的互补链所置换 l通过DNA连接酶作用，将各段互补链连接成完整DNA链 l除去残存的5’末端RNA片段，并用T4 DNA聚合酶削平3’端突出 的单链cDNA，得到一个双链形式的cDNA片段 l该方法直接利用第一链反应产物，避免了中间处理和纯化过程 造成的cDNA损失，是目前合成cDNA第二链的常用方法置换合成法合成cDNA第二链的技术流程 二、园艺植物cDNA文库的构建 （一）普通cDNA文库的构建l双链cDNA的合成 l同聚物引导法 l在第一链的3′端用末端转移酶加上一段同聚体dG l以oligo (dC)为引物合成第二链 l该法最大的缺点是获得的cDNA 5’端上游有一段dG:dC残基，可能会抑制表达过程中DNA的转录但该法在最佳条件下可高效克隆mRNA的5’端序列cDNA第二链的合成 dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列5‘ppp’5GGAAAAAOH 3’TTTTTp 5’3‘ HO5‘ppp’5GGAAAAACCCCCCCOH 3’3‘ HOCCCCCCCTTTTTp 5’3‘ HOCCCCCCCTTTTTp 5’3‘ HOCCCCCCCTTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG3‘ HOCCCCCCCTTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGGAAAAAOH 3’NaOH退火KlenowdNTPs二、园艺植物cDNA文库的构建 （一）普通cDNA文库的构建 l双链cDNA的克隆 lcDNA的修饰 l为了提高双链cDNA片段与载体的连接效率，需要对cDNA 进行修饰，即给平端的双链cDNA片段添加衔接头。
l所谓衔接头是人工合成的含有限制酶酶切位点的短双链 DNA片段，或者一端为限制酶粘性末端的双链DNA片段 l用前一种衔接头连接后，为了避免限制酶对cDNA片段内部可能出现的酶切位点的切割，在添加衔接头之前，文库 cDNA需经甲基化酶处理 l添加后一类型的衔接头时，不必对文库cDNA进行修饰合成接头和衔接头cDNA合成接头 (含酶切位点)酶切NotI, SalI与载体连接Optional: methylation• 接头中含稀有位点，如NotI, SalI(100kb一次)•先甲基化ds cDNA，再连接接头•用衔接头替换接头31/100二、园艺植物cDNA文库的构建 （一）普通cDNA文库的构建 l双链cDNA的克隆 lcDNA的克隆 l将制备的cDNA成功克隆到载体中去的关键问题是cDNA和载体的比例 l必须寻找一个适当的比例以避免单个重组体中含有多个串 联cDNA分子或产生过高的非重组背景 l为提高连接反应效率，可在连接混合物中加适量PEG 8000 l建成的cDNA文库一般应进行效价测定并扩增，以利多次筛选并长期保存cDNA文库构建流程示意图 二、园艺植物cDNA文库的构建 （一）普通cDNA文库的构建 l普通cDNA文库存在的主要不足 l低丰度表达序列在文库中出现的几率很低，要想得 到低丰度表达基因，至少要筛选106个克隆。
l构建普通cDNA文库所需的mRNA量比较大，达到数微克 l筛选普通 cDNA文库的工作复杂，需要很长时间，限制了基因克隆的速度二、园艺植物cDNA文库的构建 （二）新型cDNA文库的构建 lPCR介导的cDNA文库 l原理：以cDNA第一链为模板，设计一组引物，通过 PCR扩增获得多拷贝双链cDNA l优点：增加低丰度mRNA的克隆机会；利用仅有的 几个细胞或微量的mRNA建立较大的cDNA文库 l缺点：PCR合成的片段一般较短，大片段的全长扩 增困难；扩增过程中错误掺入率甚高；由于PCR对 短片段的扩增效率高于长片段，故mRNA的原始丰度难以在文库中体现 l应用：适合于克隆来源困难的组织或细胞的基因二、园艺植物cDNA文库的构建 （二）新型cDNA文库的构建 l标准化cDNA文库 l定义：某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含 其中，且含量相等的cDNA文库l优点： l增加了克隆丰度极低的mRNA的机会 l能发现普通cDNA探针所不能发现的稀有转录区 l能估计大多数基因的表达水平，并发现组织特异性基因二、园艺植物cDNA文库的构建 （二）新型cDNA文库的构建l标准化cDNA文库 l构建方法 l用基因组DNA做选择杂交，所捕获的cDNA丰度与对应的基因组DNA丰度一致，其缺点是约20%的非单一拷贝基因在构建的文库中丰度偏高。
l根据cDNA退火的二级动力学特性，即稀有拷贝的cDNA较丰富拷贝的cDNA复性或杂交慢，使未复性部分的单链cDNA渐趋等化 基因组饱和杂交法§ 。