蛋白质的定量测定 福林酚法（F olin—酚试剂法）实验原理Folin一酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法 以后在生物化学领域得到广泛的应用此法的显色原理与双缩脲方法 是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量, 从而提高了检测蛋白质的灵敏度这个方法的优点是灵敏度高，比双 缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线 也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多凡干扰双缩 脲反应的基团，如-CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗 糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应，而且对后者的影响 还要大得多此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠， 硫酸铜及酒石酸钾钠组成蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸 钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物乙试剂是由磷钼酸和磷钨 酸、硫酸、溴等组成此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的 酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比此法也适用 于测定酪氨酸和色氨酸的含量本法可测定范围是25—250 ug蛋白质。
试剂和器材一、试剂Folin一酚试剂:试剂甲：1） 4%碳酸钠溶液2） 0. 2mol/L氢氧化钠溶液3） 1%硫酸铜溶液4） 2%酒石酸钾钠溶液临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液3）与 （4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液然后这两种试剂按50:1 的比例配合，即成Folin—酚试剂甲此试剂临用前配制，一天内有效试剂乙：称钨酸钠（Na2W02?2H20） 100g，钼酸钠（Na2Mo04?2H20） 25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL充 分混匀，使其溶解小火加热，回流10h （烧瓶内加小玻璃珠数颗，以 防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiS04） 150g,蒸馏水50mL及液溴数滴 在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴冷却后定容至1000mL， 过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色置棕瓶中，可在冰箱长期保存若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿， 可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度以之滴定标准氢氧化钠溶液（1 mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红一紫红一紫灰一墨绿 时即为滴定终点。
该试剂的酸度应为2m ol/L左右，将之稀释至相当于1 mol/L酸度应用二、标准和待测蛋白质溶液1. 标准蛋白质溶液结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量， 根据其纯度配制成150ug/mL蛋白溶液2. 待测蛋白质溶液人血清，使用前稀释150倍三、器材试管 1.5X15cm(X6)，试管架，移液管 0.5mL (X2)； 1mL (X2)； 5mL (X1)；恒温水浴；分光光度计操作方法一、制作标准曲线 取7支试管，按下表平行操作：试管编号试剂处理1234567标准蛋白质溶液（mL）00.10.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）0.9 0.80.60.40.20Folin-酚甲试剂（mL）5.05.05.05.05.05.05.0摇匀，于20—25°C放置10minFolin-酚乙试剂（mL）0.50.50.50.50.5 0.5迅速摇匀，30°C（或室温20—25°C）水浴保温30min,以蒸馏水为空 白，在640nm处比色A640绘制标准曲线：以A640值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标 纸上绘制标准曲线二、未知样品蛋白质浓度测定 取2支试管，按下表平行操作：试管编号试剂处理空白管X2样品管X2血清稀释液 (mL)00.2蒸馏水 (mL)1.00.8Folin 一酚甲试剂(mL)5.05.0摇匀，于20—25°C放置10minFolin 一酚乙试剂(mL)0.5迅速摇匀，30°C（或室温20—25°C）水浴保温30min,以蒸馏水为空白，在640nm处比色A640三、计算注意事项⑴Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin—酚甲试剂是在碱 性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜一蛋白质溶液。
当Folin—酚乙试 剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸 －磷钨酸试剂被破坏之前2） 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此 范围则需将血清酌情稀释。