丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品蛋壳粉制备氨基酸螯合钙工艺优化蔡巽楷（华南农业大学食品学院）摘 要：随着我国禽蛋业的快速发展，其不可食用部分蛋壳大量产生它是一种以碳酸钙形式存在的高度结合生物钙，不易被动物机体消化吸收本文以禽蛋加工下脚料蛋壳为原料，通过酸水解制备可溶性钙，调节pH后与甘氨酸螯合制备氨基酸螯合钙其具有良好的化学和生化稳定性，生物学效价高等特点，能达到既补充氨基酸又补充钙的双重功效结果表明，蛋壳粉酸水解最佳工艺条件为：1.0g蛋壳粉加入10mL 2moL/L的盐酸，在50℃下酸水解15min此条件下，可溶性钙得率为387.0mg/g；氨基酸螯合钙的最佳工艺条件是：可溶性钙和甘氨酸质量比为1：6，在pH为4.8， 60℃下螯合反应1.5h此条件下，可溶性钙的螯合率高达89.32%因此，以蛋壳为原料，经酸水解溶出可溶性钙再与甘氨酸螯合制备氨基酸螯合钙补钙制剂，为禽蛋加工废弃物的综合利用提供新途径关键词：蛋壳粉；甘氨酸；氨基酸螯合钙；螯合反应；钙是我们生命必不可少的元素，是构成骨骼、牙齿的主要成分，在血液凝结、某些酶的活化、维持神经的传导性能、肌肉的伸缩性、毛细血管的下沉渗透压、体内的酸碱平衡等方面起着重要的作用[1]。
它对维持人体的循环、呼吸、神经、消化、内分泌、肌肉、骨骼、泌尿及免疫等系统的正常生理功能具有重要意义[2]青少年骨胳发育不良，老年人的骨质疏松、骨质增生大都是缺钙引起，结肠癌、高血压、糖尿病、衰老也与缺钙有关[3]氨基酸螯合钙，是1个或多个氨基酸基团与金属钙发生配合反应形成的具有环状结构的化合物其具有良好的化学和生化稳定性，生物学效价高等特点，能达到既补充氨基酸又补充钙的双重功效[4]氨基酸鳌合钙易于被人体吸收，副作用小，生物利用率高，并且在补充钙元素的同时又可补充人体必需的氨基酸，是一种较理想的钙营养强化剂[5] 禽蛋是人类优质动物性食品，随着禽蛋生产与消费的日益增加，其不可食用部分——蛋壳大量产生[6]蛋壳是一种完全高度结合的生物钙，由无机物和有机蛋白质组合而成，其平均含量为93%的碳酸钙、1%的碳酸镁、3.2%的磷酸钙和磷酸镁无机物以及2.89%的有机物 [7，8]2006年，Joseph H等发明了一种利用摩擦力将蛋壳膜从蛋壳上分离的设备，该设备将蛋壳膜从蛋壳上摩擦掉后将蛋壳和蛋壳膜分别回收[9]基于蛋壳资源数量巨大，永不衰竭，综合利用深度加工就显得特别必要现代蛋制品加工业的发展将在很大程度上改变蛋壳来源分散、不易收集、污染严重的现状。
本实验以蛋壳粉等为原料，通过正交实验优化酸水解制备可溶性钙的工艺条件和氨基酸螯合钙的最佳螯合条件旨在为氨基酸螯合钙补钙制剂的研制和禽蛋下脚料的综合利用开拓一条新的途径，为开发以钙为营养素的产品提供理论依据1 材料与仪器1.1 材料废弃蛋壳；盐酸 上海申翔试剂有限公司；氢氧化钠 天津市大茂化学试剂厂；氨水 天津市富宇精细化工有限公司；无水乙醇 天津市瑞金特化学品有限公司；乙二胺四乙酸 天津市大茂化学试剂厂；乳酸 天津市永大化学试剂有限公司；乙酸 天津市富宇精细化工有限公司；钙-羧酸指示剂 上海灵锦精细化工有限公司1.2 仪器高速中药粉碎机：瑞安市环球药械厂；DGG－9070B电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；100目国家标准检验筛：浙江上虞市道墟五四仪器纱筛厂；电子天平YP6000 上海第二天平仪器厂；pH S-25酸度计，上海雷磁仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；SHZ-88台式水浴恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂1.3 方法1.3.1 蛋壳粉酸解制备可溶性钙（1）蛋壳粉酸解提取可溶性钙工艺流程废弃蛋壳→清洗→60℃下烘干→粉碎→过100目筛→蛋壳粉→酸解→过滤→测定可溶性钙含量→制得蛋壳酸解液（2）蛋壳粉水解酸种类的选择称取1g筛选过的样品，分别加入到 2ml 6mol/L的盐酸、乳酸、乙酸中，加入 8mL的蒸馏水，在温度 100℃的条件下水解30min，测各酸水解液中可溶性钙含量。
3）蛋壳粉酸水解工艺优化称取1.0g蛋壳粉，以可溶性钙得率为指标，选取不同盐酸体积、不同盐酸浓度、水解时间和水解温度四因素，进行 L9（34）正交试验，其试验因素水平见表1表1 酸水解正交因素水平表 因素水平A盐酸体积/mLB盐酸浓度/mol/LC水解时间/minD水解温度/℃141.0530271.510403102.015501.3.2 氨基酸螯合钙的制备工艺优化（1）蛋壳粉酸解液与甘氨酸螯合工艺流程酸水解液→ 调节 pH→加入甘氨酸→一定比例混合 →搅拌 →螯合 →加无水乙醇沉淀→离心→沉淀物→干燥→氨基酸螯合钙（2）氨基酸螯合钙制备工艺条件选择调节蛋壳粉水解液pH值后，加入不同比例甘氨酸，在不同温度下螯合反应一定时间后，用无水乙醇沉淀螯合物，离心后测定上清液中游离钙含量并计算螯合率3）正交实验在单因素实验的基础上，以螯合率为指标，选取甘氨酸与游离钙摩尔比、pH 值、反应温度、反应时间四因素，进行 L9（34）正交试验，其试验因素水平见表2表2 螯合反应因素水平表因素水平A 摩尔比B pH值C 螯合时间/hD 螯合温度/℃11:44.415021:54.61.56031:64.82701.3.3 测定方法（1）游离态钙含量的测定: 采用GB/T 5009.92-2003 食品中钙的测定——EDTA滴定法。
2）氨基酸螯合钙螯合率的计算：W1—反应体系中钙的含量（mg）；W2—反应后体系中钙的含量（mg）2 结果与分析2.1 蛋壳粉酸水解工艺实验结果2.1.1 水解酸种类的选择取1g蛋壳粉，分别加入2ml 6mol/L的盐酸、醋酸、乳酸和柠檬酸，在加入8ml蒸馏水酸解30min，测定酸水解液中可溶性钙得率，结果如图1图1 不同酸对可溶性钙得率的影响 从图1可以看出，盐酸对蛋壳粉中钙离子的溶出效果较好，其次为盐酸和乳酸，柠檬酸的效果最差四种酸和蛋壳粉接触时，均发生剧烈反应，产生大量白色气泡无机酸对蛋壳中钙离子的溶出效率较高，而有机酸易于钙离子形成有机酸钙，不利于可溶性钙的制备因此，选取盐酸作为蛋壳酸水解制备可溶性钙的酸2.1.2 蛋壳粉酸水解正交试验结果 采用L9(34)正交表，以盐酸体积、盐酸浓度、水解时间和水解温度为因素设计正交试验，确定酸水解的最佳工艺条件，正交试验结果见表3 表 3 蛋壳粉酸水解制备可溶性钙正交实验结果 样品号A盐酸体积/mLB盐酸浓度/mol/LC水解时间/minD水解温度/℃可溶性钙得率mg/g11（4）1（1）1（5）1（30）92.60212（1.5）2（10）2（40）133.50313（2）3（15）3（50）274.5042（7）123153.8052231230.8062312289.2073（10）132221.5083213303.7093321313.70K10.1670.1560.2280.212K20.2250.2230.2000.215K30.2800.2920.2420.244极差0.1130.1360.0420.032由表3极差分析可知，盐酸体积和盐酸浓度对钙的溶出效果影响存在着极显著差异，而酸解时间和酸解温度对钙的溶出效果影响不显著。
因素主次因素顺序为：B>A>C>D，因素水平最佳组合为B3A3C3D3因此，蛋壳粉酸水解制备可溶性钙的最佳工艺条件为：1g蛋壳粉加入10mL 2moL/L的盐酸，在50℃下酸水解15min此条件下，可溶性钙得率为387.0mg/g2.2 钙与甘氨酸螯合工艺条件的选择2.2.1摩尔比对螯合反应的影响 选取不同钙含量与甘氨酸摩尔比，于 pH 值5.0，60℃下螯合反应 60min用无水乙醇沉淀氨基酸螯合钙后，测定反应体系中游离钙含量并计算钙离子螯合率，结果如图2 图2质量比对螯合反应的影响 由图2可知：随着甘氨酸用量不断增加，螯合后游离钙逐渐减少，螯合率逐渐增大当钙离子和甘氨酸质量比值为 1∶6时，钙离子利用最充分，螯合率最高若继续增加甘氨酸用量，则难以完全溶解，故不能继续增加甘氨酸用量2.2.2 pH 值对螯合反应的影响按钙含量与甘氨酸摩尔比为1：3，分别在不同pH 条件下，在60℃螯合反应 60min用乙醇沉淀氨基酸螯合钙后，测定反应体系中游离钙含量并计算钙离子螯合率，结果如图3图3 pH对螯合反应的影响 由图3可知：随着pH值的增大，钙离子的螯合率呈先增大后减小；当pH为4.6时，钙离子的螯合率达到最大值。
若继续增大pH值，螯合环境引起副反应，钙离子螯合率降低，所以最适pH为4.62.2.3螯合时间对螯合反应的影响按钙含量与甘氨酸摩尔比为1：3，于 pH 值5.0下，在60℃下分别螯合不同时间用乙醇沉淀氨基酸螯合钙后，测定反应体系中游离钙含量并计算钙离子螯合率，结果如图4图4螯合时间对螯合反应的影响由图4可知：随着螯合时间的增大，钙离子的螯合率呈先增大后减小变化；当螯合时间为1.5h时，钙离子的螯合率达到最大值若继续增加螯合时间，可能由于搅拌作用引起螯合物的降解，导致钙离子螯合率下降，所以最适螯合时间为1.5h2.2.4 螯合温度对螯合反应的影响按钙含量与甘氨酸摩尔比为1：3，于 pH 值5.0下，在不同温度下分别螯合1h用乙醇沉淀氨基酸螯合钙后，测定反应体系中游离钙含量并计算钙离子螯合率，结果如图5图5螯合温度对螯合反应的影响由图5可以看出，随着螯合温度的增大，钙离子的螯合率呈先增大后减小变化；当螯合温度为60℃时，钙离子的螯合率达到最大值若继续提高螯合温度，会引起螯合物的降解，导致钙离子螯合率降低，所以螯合的最佳温度为60℃2.3 螯合正交优化试验结果 根据单因素试验结果，选择质量比、pH值、时间和温度作为影响因素，按L9（34）设计正交试验，正交试验结果见表4。
表4 螯合反应正交实验结果样品号A质量比BpH值C螯合时间/hD螯合温度/℃螯合率/%11（1：4）1（4.4）1（1）1（50）64.90212（4.6）2（1.5）2（60）75.43313（4.8）3（2）3（70）69.2142（1：5）12377.185223176.656231282.4573（1：6）13285.638321386.719332188.24K169.84775.90378.02076.597K278.76079.59780.28381.170K386.86079.96777.16377.700极差17.01。