饼干中菌落总数与大肠菌群的测定GB/T4789.24 食品卫生微生物学检验 糖果，糕点，蜜饯检验项目指标非夹心饼干 夹心饼干菌落总数/（cfu/g） W750 2000大肠菌群(MPN/100g) W30霉菌计数/（cfu/g） W50致病菌（沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌）不得检出一、检测对象散装饼干，小包装饼干二.仪器用具1仪器髙压蒸汽灭菌锅、电热干燥箱、恒温培养箱（361 土10 冰箱（21-51 ）、电子天平、电炉等2用具无菌吸量管（ImL）、放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、灭菌试管平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶、小倒管等三．食品的采样方法 采样应遵循无菌操作程序，采样工具和容器应无菌、干燥、防漏，形 状及大小适宜1. 即食类预包装食品取相同批次的最小零售原包装，检验前要保持包装的完整，避免污染2. 散装食品或现场制作食品根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位，用无 菌采样器现场采集5倍或以上检验单位的样品，放入无菌采样容器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求3. 采集样品的标记 应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记，采样人应清晰填写采 样单（包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、 保存条件等信息）。
4.5采集样品的贮存和运输采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验 运输时应保持样品完整如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条 件下贮存四．菌落总数的测定1.菌落总数aerobic plate count：食品检样经过处理，在一定 条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g （mL） 检样中形成的微生物菌落总数2. GB 4789.2－2010 菌落总数测定流程检样25 g(mL)样品+225 mL稀释液，均质10 倍系列稀释I卄「选择2个二3个适宜稀释度的样品匀液，、各取1见 分别加入无 菌培养皿内，每皿中加入15 mL〜20 mL平板计数琼脂，混匀I36 °C ±1 °C，48 h 土 2 h培养，计数各平板菌落数I报告2. 菌落计算公式有两个稀释度的菌落数在合适范围，按照如下公式计算：N 二工 C / [n1 + (0.1Xn2) ] X (d)N =样品中菌落数二平板菌落数之和n1 = 含合适范围菌落数的第一稀释度(低)平板数n2 =含合适范围菌落数的第二稀释度(高)平板数 d =第一稀释度(低)3. 平板计数琼脂培养基成分A胰蛋白胨5.0gB 酵母浸膏2.5 gC 葡萄糖1.0 gD 琼脂15.0 gE 蒸馏水1000 mLpH 7.0 +/- 0.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH •分装试管或锥形 瓶，经121°C髙压灭菌15min.五．大肠菌群的测定1.GB 4789.3－2010大肠菌群计数a. 检样25 g+225 mL稀释液b. 适当十倍稀释样品c. 选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST 肉汤（每管9 mL LST肉汤并加有导管），每管接种1 mLd. 36C ，24 ± 2 h ~48± 2 he. 没有产气管有产气管，报告阴性有产气管，接种BGLB肉汤管,36 土 C,48 土2h,查MPN表报告结果（大 肠菌群）.有产气管，接种EC肉汤,44.5土0.5 C （水浴培养）,24 土 2 h ~48 土2 h.产气管接种EMB平板（36C、18~24 h）.从EMB平板上挑取5个可 疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气，查MPN表报告结果（大肠杆菌）2．培养基I .LST成份胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g乳糖5.0 g氯化钠5 .0g磷酸氢二钾2.75g磷酸二氢钾2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000 mLpH 6.8 +/- 0.2制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH.分装到有玻璃小倒管的试 管中，每管10mL。
121°C髙压灭菌15min.II、BGLB成份蛋白胨 10.0 g乳糖10.0 g牛胆粉溶液200ml0.1%煌绿水溶液 13.3 ml蒸馏水 800 mLpH 7.2 +/- 0.1制法将蛋白胨,乳糖 溶解于500ml蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200ml,用蒸馏水稀释到975ml,调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 ml，用蒸馏水补足到1000ml，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的 试管中，每管10mL121°C髙压灭菌15min.III.EC肉汤成份胰蛋白胨 20.0 g3号胆盐（或混合胆盐） 1.5g乳糖 5 g磷酸氢二钾 4g磷酸二氢钾 1.5g氯化钠 5 .0g蒸馏水 1000 mLpH 6.9 +/- 0.2制法将上述成分混合，溶解于蒸馏水中，调节pH.分装到有玻璃小倒管的 试管中，每管10mL121C髙压灭菌15min.六．霉菌和酵母计数1. 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 冰箱：2 °C〜5 °C,恒温培养箱：281 土1 °C,均质器（不能旋转刀）， 恒温振荡器，显微镜：10X〜100X,电子天平：感量0.1 g,无菌 锥形瓶：容量500mL、250 mL,无菌广口瓶：500 mL,无菌吸管:1mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具0.1 mL刻度）,无菌平皿：直径90mm,无 菌试管：10 mmX75 mm,无菌牛皮纸袋、塑料袋。
2. 培养基和试剂马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A中A.1孟加拉红培养基：见附录A中A.2马铃薯－葡萄糖琼脂培养基,附加抗菌素孟加拉红培养基灭菌蒸馏水3 操作步骤3. 1样品的稀释3. 2根据对样品污染状况的估计,选择2个〜3个适宜稀释度的 样品匀液（液体样品可包括原液）,在进行10倍递增稀释的同时, 每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内同时分别取 1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照3.3培养待琼脂凝固后，将平板倒置，28 C±1C培养5d,观察并记录3.4菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和 酵母数以菌落形成单位(colony forming units, CFU)表示选 取菌落数在10 CFU〜150 CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和 酵母数霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计菌落数应 采用两个平板的平均数4. 结果与报告 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。