货号：MS1202 规格：100管/96样谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定测定意义：GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一GSH-Px 不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜 免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属 离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力测定原理：GSH-Px催化HO氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，22同时NADPH氧化生成NADP+； NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm光吸收 减少速率来计算GSH-Px活性自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、 和蒸馏水试剂组成和配置：试剂一：液体XI瓶，室温保存试剂二：粉剂X1瓶，4°C保存试剂三：液体XI支，-20C保存混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一 20mL，充分震荡溶解后加入全部试剂三, 混匀。
当天用完）试剂四：液体XI 瓶, 4C保存粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）:试剂一体积（mL）为1： 5~10的比例（建议称取约0.lg组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆8000g，4C离心10min，取上清置冰上待测2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000： 1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后8000g，4C,离心10min,取上清置于冰上待测3. 血清等液体：直接测定GSH-Px 测定操作：1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零2. 混合试剂在25C或者37C（哺乳动物）水浴中预热30min3. 空白管：依次在微量石英比色皿或96孔板中加入20p L蒸馏水、160卩L预热的混合试剂，20 M L试剂四，迅速混匀后于340nm处测定第10s和第190s的吸光值，分别记为A空1和A空2 △A空白管二A空1 - A空24. 测定管：依次在微量石英比色皿或96孔板中加入20m L上清液、160m L预热的混合试剂， 20m L试剂四，迅速混匀后于340nm处测定第10s和第190s的吸光值，分别记为A测1和A测2。
△A测定管=A测1 - A测2GSH-Px 活性计算：a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1） . 按蛋白浓度计算GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每mg蛋白每分钟催化lnmol NADPH氧化为1个酶活单位 GSH-Px （nmol/min/mg prot）二［（△A测定管-AA空白管）三£ FdXV 反总 X109］^（CprXV 样）FT=536X（AA测定管-AA空白管）FCpr（2） . 按样本质量计算GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每g样本每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位 GSH-Px （nmol/min/g） = ［（△测定管-AA 空白管）三£ FdXV 反总X 109］ ^（WXV 样FV 样总）FT=536X（AA测定管-AA空白管）FW（ 3）按细胞数量计算活性单位定义：一定温度中，每104个细胞每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位 GSH-Px （nmol/min/104cell）= ［（AA测定管-AA空白管）三£ FdXV反总X 109］ F （细胞数量XV样FV样总）FT=536X （AA测定管-AA空白管）F细胞数量（ 4 ）按液体体积计算活性单位定义：一定温度中，每毫升液体每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px （nmol/min/mL） = ［（AA 测定管-AA 空白管）三£ FdXV 反总X 109］ FV 样ft =536X （AA测定管-AA空白管）£ : NADPH摩尔消光系数6.22X 103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1 cm； V反总：反应体系总 体积，200》L=2X10-4 L； 106： 1 mol=1X106》mol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）； W : 样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20》L =2X10-2 mL； V样总：提取液体积，1mL； T：反应时间，3 minb. 使用96孔板测定的计算公式如下（1） . 按蛋白浓度计算GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每mg蛋白每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位 GSH-Px （nmol/min/mg prot） = ［（AA 测定管-AA 空白管）三£ FdXV 反总X 109］ F（CprXV 样）FT=1072X（AA 测定管-AA 空白管）FCpr（2） . 按样本质量计算GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每g样本每分钟催化1 nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px （nmol/min/g） = ［（△测定管-AA 空白管）F£ FdXV 反总X 109】F（WXV 样FV 样总）FT=1072X（AA测定管-AA空白管）FW（ 3）按细胞数量计算活性单位定义：一定温度中，每104个细胞每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位GSH-Px （nmol/min/104cell）= ［（AA测定管-AA空白管）Fz FdXV反总X 109］ F （细胞数量 XV样FV样总）FT=1072X（AA测定管-AA空白管）F细胞数量（ 4）按液体体积计算活性单位定义：一定温度中，每毫升液体每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位GSH-Px （nmol/min/mL） = ［（AA 测定管-AA 空白管）F£ FdXV 反总 X 109］ FV 样FT =1072X （AA测定管-AA空白管）£ ： NADPH 摩尔消光系数 6.22X103 L/mol/cm； d： 96孔板光径， 0.5 cm； V 反总：反应体系 总体积，200》L=2X 10 -4 L； 106： lmol=lX106》mol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）； W : 样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20》L =2X10-2 mL； V样总：提取液体积，ImL； T：反应时间，3min。
注意事项：（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；（ 2）混合试剂和底物液须临用前配制，配完后置于冰上，当天使用完；（ 3）测定过程操作须迅速；（4）细胞中GSH-Px活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GSH-Px的提取时可加 试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。