动物肝脏中DNA勺提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA ,为英文Deoxyribo nucleic acid 的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分， 同时也 是组成基因的材料有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程 中，父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成 性状的传播DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘 度，可被甲基绿染成绿色DNA对紫外线（260nm ）有吸收作用， 利用这一特性，可以对DNA进行含量测定当核酸变性时，吸光度 升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原 来的水平较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引 起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解 开一也称为DNA的解螺旋在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统 称为染色体组对于人类而言，正常的体细中含有 46条染色体染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划 分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后 期对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细 胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟 核内。
染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将 DNA进行组织 并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的 转录脱氧核糖核酸的结构DNA的结构：DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、 三级结构和四级结构四个水平DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌 呤脱氧核苷酸（dAMP脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP脱 氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核 苷酸（dGMP脱氧鸟苷）而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由 酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧每 个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着 DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成读取密码 的过程称为转录，是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称 为mRNA （信使RNA ）的核酸分子DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用 3 '， 5 '-磷酸二酯键相连构成的长链大多数 DNA含有两条这样的长链，也有 的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体 © X174、G4、M13等DNA 有环形DNA和链状DNA之分在某些类型的 DNA中，5-甲基胞 嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶 特别丰富。
在某些噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶40年 代后期，查加夫（E.Chargaff ）发现不同物种DNA的碱基组成不同， 但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数 （A=T ），鸟嘌呤数等于胞嘧啶 数（G=C），因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和，一般用几个层次描绘 DNA的结构浓盐法从动物组织中提取DNA核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在， 其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液，但在 0.14 M的盐溶液中溶解 度很低，而RNP则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的 NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来将抽提得到的DNP用SDS处理可 将其分离DNA和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得 DNA上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出肝脏细胞肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微 镜才能看到人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细胞组成一个肝 小叶，因此人肝的肝小叶总数约有 50万个肝细胞为多角形，直径 约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异， 如饥饿时肝细胞体积变大每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞 面和面三种肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构：如肝细胞核、 肝细胞质、、内质网、、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。
二、实验目的1. 掌握浓盐法从动物组织中提取 DNA的原理与技术三、实验原理核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白 ( DNP/RNP )的形式存在， 其中 DNP 能溶于水及高浓度盐溶液，但在 0.14 M 的盐溶液中溶解 度很低，而 RNP 则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的 NaCl 溶液将其从样品中分别抽提出来将抽提得到的 DNP 用 SDS 处理可将其分离 DNA 和蛋白质，用 氯仿 -异戊醇将蛋白质沉淀除去可得 DNA 上清，加入冷乙醇即可将 其呈纤维状析出四、实验器材和材料试剂实验器材：① 匀浆器② 量筒③ 离心机④ 离心管⑤ 试管⑥ 吸管⑦ 恒温水浴锅实验材料：① 猪肝实验试剂：① O.1mol/L NaCI-0.05mol/L 柠檬酸钠溶液（pH6.8 ）② 95%乙醇（A.R.）③ NaCI 固体（A.R.）④ 5%SDS溶液（5g SDS 定容至100ml ）⑤ V（氯仿）:V （异戊醇）20 : 1的混合液五、实验操作1. 称量① 称取一定 质量的 猪肝，加 入 2 倍肝重的 0.1mol/LNaCl-0.05mol/L 柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎（已完成）2. 提取 DNA① 量取肝糜 4 ml 于 10 毫升离心管，在 4000r/min 下离心10min ，沉淀中再加入 8 ml 缓冲液于 4000r/min 离心 5 min ；② 弃上清，取沉淀；③ 将沉淀用 10 ml 柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、加入5 ml氯仿-异戊醇混合液、1 ml SDS，振荡30min （保鲜膜封口）；④ 缓慢加入固体NaCl （约0.9g ），使其最终浓度为1mol/L ；⑤ 将溶液分装到 2 个 10 毫升离心管中，在 4000r/min 离心 5 min ，取上清水相；⑥ 在上述水相溶液中分别加等体积冷 95% 乙醇，边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动， 将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的 乙醇，即得 DNA 粗品；⑦用8ml蒸馏水溶解DNA粗品于10ml离心管中3. 标准曲线的绘制按下表加入各种 试剂，混匀，于60 C恒温水浴锅45min，冷却后，在595nm 波长下于分光光度计比色测定，以吸光度对 DNA浓度作图，制作标准曲线012345标准DNA溶液/ml0.00.40.81.21.62.0蒸馏水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺试剂/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm4.样品的测定将DNA粗品定容至25ml容量瓶，再取DNA样液1.0ml，加入蒸馏水1.0ml，混匀。
然后准确加入二苯胺试剂 4.0ml，混匀，于60 C恒温水浴锅45min ,冷却后，595nm波长下于分光光度计比色 测定，根据所测的吸光度对照标准曲线求得 DNA的质量（ug ）5.计算100g猪肝中DNA含量w=m1/m2 X100%w : DNA的质量分数（%）ml :样液中测得的DNA的质量（ug ）m2 :样液中所含样品的质量（ug ）六、实验数据处理1.标准曲线012345标准DNA溶0.00.40.81.21.62.0液/ml蒸馏水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺试剂4.04.04.04.04.04.0/mlA595nm00.0390.090.1460.1970.249DNA含量080160240320400/uga 0.05 0 丄 0丄5 0.2 025 032. 实验结果处理猪肝质量为2.04gDNA提取液体积为12.53ml序号123A595nm0.1020.1020.101平均A595nm0.102样液中DNA含量/ug171.4样液中样品质量/g0.1628根据公式w=m1/m2 X100%得：w=0.1053 %则100g猪肝中DNA 含量为：w xi00=0.1053g七、思考题1. 实验中的乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用？答：①柠檬酸的钠盐在实验中既充当 DNA酶的抑制剂，也是 pH 缓冲溶液；② SDS是表面活性剂，可以让蛋白质与 DNA分开；③ 氯仿是有机溶剂， 可以使蛋白质聚集沉淀， 便于分离出去；④ 异戊醇是消泡剂，可以减少泡沫的发生；⑤ 氯仿 -异戊醇的作用是使、膜溶解；⑥ NaCI固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液，在这样的 环境中 DNA 核蛋白能溶解， RNA 核蛋白则溶解度很低，可以利用 这一性质分离两种核酸。
八、实验注意事项1. DNA 主要集中在细胞核中，因此，通常选用细胞核含量比例 大的生活组织作为提取制备 DNA 的材料，小牛胸腺组织中细胞核比 例较大，因而 DNA 含量丰富，同时其脱氧核苷酸酶活性较低，制备 过程中 DNA 被降解的可能性相对较低，所以是制备 DNA 的良好材 料，但其来源较困难，脾脏或肝脏易获得，也是实验室制备 DNA 常 用的材料，本实验用新鲜肝脏作为实验材料2. 为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，须采取以下措施： 整个过程必须在低温下进行， 可加入某些物质抑制核酸酶的活性， 如 柠檬酸钠、 EDTA、SDS 等， EDTA 是抑制核酸酶的活性最好的抑制 剂3. 从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多，经常采用的有：氯仿 - 异 丙醇法、苯酚法、去垢剂法等，他们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚， 并释放出核酸4. 使用离心机时，对称放置的离心管必须用天平调平衡5. 避免剧烈振荡，如研磨过程、搅拌过程等九、实验结果误差分析及讨论 经过对本次实验结果进行分析，得出 100g 猪肝中 DNA 含量大约为 0.1053g 的结论，在上网查阅相关资料后发现：猪肝中 DNA 含量与 本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合。
由此可知， 本次试 验结果是相对比较成功的，较为粗略地测量出猪肝中 DNA 的含量， 并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取 DNA 的原理与技 术，基本达到了本次实验的目的但是本次实验结果只是粗略测量，并未达到精确测量猪肝中DNA 的含量，且实验数据较理论值偏低，这是由于某些误差导致， 在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差， 经分析得出 以下几点：① 在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中， 由于猪 肝组织表面较滑不易磨碎， 且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残 留，因此可能导致猪肝中 DNA 提取不充分，致使实验数据较理论值 偏低；② 研磨过程中， 可能由于操作不当，导致部分液体溅出，因此可能使得提取液中部分 DNA 损失，导致实验数据偏低；③ 在粗提取 DNA 操作中，频繁地将 DNA 提取液转移至各个仪 器内，可能有极小部分 DNA 提取液未倒净， 残留在仪器壁上损耗掉， 导致实验误差；④ 在使用移液枪的过程中， 可能因为操作不当或移液枪经常错误 使用，出现仪器误差， 导致吸取的 DNA 样液不精确， 出现实验误差；⑤ 在水相中加入乙醇析出 DNA 时，不是。