摘要 已分化的细胞能通过将核物质转移入卵母细胞或与胚胎干细胞融合而重编程至胚胎细胞样状态我们对诱导这种 重编程过程的因子知之甚少在这里，我阐述了通过四个因子，Oct3/4, Sox2, c-Myc,and Klf4,在胚胎干细胞 培养条件下将鼠胚胎或成体纤维母细胞向多能干细胞的诱导出乎意料的是，Nanog不是必须的这些细胞被我 们称为诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell,iPS cell)，它们表现出胚胎干细胞(embryonicstem cell,ES cell)的形态和属性，并且表达胚胎干细胞的标记基因将iPS cells皮下注射转移至裸鼠导致包含所 有三个胚层的一系列组织的肿瘤的形成接下来将其注射进入鼠囊胚，iPS cells导致了鼠胚胎的发育这些数 据证明，多潜能干细胞能通过仅仅添加一些确定的因子而从纤维母细胞培养物中直接生成简介起源于哺乳动物囊胚内细胞团的胚胎干细胞维持在多潜能性时具有无限生长的能力，并且能分化成三个胚层内的 的所有细胞( Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981)人类胚胎干细胞被认为能治疗许多疾病，例如 Parkinson's disease，spinal cordinjury, and diabetes (Thomson et al., 1998 )。
尽管如此，就像病人 移植后组织排斥反应的问题一样，人类胚胎的使用面临着巨大的伦理困难避免这些问题的唯一途径是从病人自 体细胞直接生成多潜能细胞体细胞能够通过将核物质转移进卵母细胞(Wil mu t et al., 1997)或与胚胎干细胞融合(Cowanet al., 2005; Tada etal., 2001)而重新编程这表明未受精的卵子和胚胎干细胞含有能授予体细胞生物全能性或多潜能性的因子 我们假设这些因子在维持胚胎干细胞的特性方面起重要作用，在体细胞多潜能性的诱导中也起关键作用数个转录因子，包括 Oct 3/4 (Nichols et al., 1998; Niwa et al., 2000), Sox2 ( Avilion et al., 2003),and Nanog ( Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003)，对早期胚胎和胚胎干细胞多能性的维持有作用一 些在肿瘤组织中经常表达上升的基因，如Stat3 (Ma tsuda et al.,1999; Niwa et al., 1998 ), E-Ras ( Takahashiet al., 2003),c- myc ( Cartwright et al., 2005), Klf4 ( Li et al., 2005), and b-catenin (Kielman et al., 2002; Sato et al., 2004)，已被显示能使胚胎干细胞表型长效维持，并在培养中使胚胎干 细胞快速繁殖。
此外，我们还鉴定了其他数个在ES细胞上特异表达的基因(Maruyama et al., 2005; Mit sui et al., 2003)在这个试验中，我们检查了是否这些因子能在体细胞中诱导多潜能性通过结合四个被挑选出来的因子，我们能 从鼠胚胎或成体纤维母细胞培养物中直接产生多潜能细胞，我们称之为诱导多能干(iPS)细胞结果我们假设一些因子在胚胎干细胞特性的维持中起重要作用(see Table S1 in the Supplemental Data available with this articleonline)，基于此假设，我们选择24个基因作为诱导体细胞多潜能性的因子的候选基因对 于 b -ca tenin, c-Myc, and S tat 3，我们用了活性的形态，S33Y- b-ca tenin (Sado t et al., 2002 ), T58A-c-Myc (Chang et al.,2000 ), and Stat 3-C ( Bromberg et al., 1999)， respec tively因为先前已报道的 Grb2 在 多潜能干细胞中的负性作用(Burdon et al., 1999; Cheng et al., 1998)我们诱导了它的dominan t-nega tive 突变体Grb2 #SH2(Miyamo to et al., 2004)作为24个候选基因之一。
为了对这24个候选基因进行评估，我们发展了一套检测系统，在这个系统里面，多潜能状态的诱导可以作为G418 的抵抗被检测出来(Figure 1A)我们通过同源重组插入了一个0 geo cassette (0 -半乳糖胺酶和新霉素抗性 基因的混合物)到鼠Fbx15基因中(Tokuzawa et al.,2003)虽然在鼠胚胎干细胞和早期胚胎中特异性表达,Fbx15 却不是鼠发育和多潜能性维持所必须被P geo敲除构建的胚胎干细胞纯合子(Fbxl50 geo/0 geo)对非常高浓 度的G418 (up to 12 mg/ml)具有抵抗力，而来源于Fbx150 geo/p geo小鼠的体细胞则对标准浓度的G418 (0.3 mg/ml)敏感我们预期Fbx15位点的部分活化都将导致对标准浓度G418的抵抗我们通过逆转录病毒转导，从Fbx15p geo/p geo胚胎将24个候选基因的每个都引入了小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs)(Mori ta et al., 2000)然后将重组的细胞放在 STOfeeder cells in ES cell medium con taining G418 (0.3 mg/ml)中培养。
尽管如此，我们没有获得任何含有单一因子的药物抗性克隆，这意味着单个候选基因不足 以活化Fbx15位点(Figure 1 B ; see alsoTable S2, which summarizes all of the transduction experiments in this study)与此相反，转导所有24个候选基因在一起却产生了 22个G418-抗性克隆(Figure 1 B)继续选择性培养其中的 12个克隆，5个克隆表现出与胚胎干细胞相似的形态，包括浑圆的外形、较大的核仁和较少的胞浆(Figure 1 C) o 我们重复这个实验，观察到29个G418-抗性克隆，并从中挑选出6个克隆其中的四个具有与胚胎干细胞相似的 形态和增殖属性(Figure 1 D)这些细胞的倍增时间(19.4,17.5, 18.7, and 18.6hr)与胚胎干细胞(17.0 hr)相 等我们用 iPS-MEF24 特指这些细胞''pluripotentstem cells in-duced from MEFs by 24 factors''反 转录 PCR (RT-PCR )分析显示 iPS-MEF24 表达胚胎干细胞标记，包括 Oct 3/4,Nanog , E-Ras , Crip to, Dax1, and Zfp296 ( Mit sui et al.,2003) and Fgf4 ( Yuan et al., 1995 )( Figure 1 E)。
重亚硫酸盐基因组测序证实 Fbx15的启动子和Nanog在iPS细胞中被去甲基化了( Figure 1 F)与之相反的是，Oct3/4启动子在这些细胞 中保持着甲基化状态这些数据预示着这24个候选因子的某些组合诱导了 MEF培养物中胚胎干细胞标记基因的 表达下一步，为了明确这24个候选基因中哪些是关键的，我们检查了从构成G418-抗性克隆的转导候选基因中去除单 个因子的影响(Figure 2 A)我们鉴定了 10个因子(3, 4, 5, 11, 14, 15, 18, 20, 21, and22),单个这些因 子从转导组合中的移除会导致转导后10天内没有任何克隆形成，或转导后16天形成少量的克隆单独这10个 基因的组合产生了更多的胚胎干细胞样克隆，超过将24个基因都转导后所产生的数量( Figure 2 B)接下来我们从转导入MEFs中的10个因子中去掉其中的一个，然后检查形成的细胞克隆(Figure 2 B)当Oct3/4 (factor14)或Klf4 (factor 20)被移除后，就没有G418-抗性克隆形成移除Sox2 (factor15)会导致只有少 量G418-抗性克隆形成。
当我们移除c-Myc (factor 22), G418-抗性克隆确有出现，但却是扁平的，与胚胎样干 细胞不同的形态其他因子的移除并没有显著影响克隆的数量这些结果表明Oct3/4, Klf4,Sox2, and c-Myc 在MEFs形成iPS细胞过程中起重要作用这四种基因的结合产生了很多G418-抗性克隆，并且与观察到的利用10个基因形成的克隆数量相似(Figure 2 C) 我们分别从两种转导物中各自挑选了 12个克隆并继续培养，建立了 4 iPS-MEF4和5 iPS-MEF10两种克隆此 外，我们可以用野生型的c-Myc代替T58A mutant产生iPS cells (iPS-MEF4wt) ( Table S2 )这些数据证明 了 iPS细胞能通过四个转录因子(Oct3/4,Sox2, c-Myc, and Klf4)从MEF culture中诱导产生两个因子的组合不能诱导G418-抗性克隆的产生(Figure 2C)三个因子的两种组合一Oct3/4, Sox2, and c-Myc (minus Klf4)或者Klf4, Sox2, and c-Myc (minus Oct3/4)—都形成了一个单个的小克隆，但却并不能 在培养中维持。
我们观察到Oct3/4,Klf4,和Sox2 (minusc-Myc)的组合形成了 36个G418-抗性克隆，尽管如此， 它们却呈现出一种扁平的，与胚胎干细胞不同的形态Oct3/4, Klf4, and c-Myc (minus Sox2)的组合形成了 54 个G418-抗性克隆，我们从中挑取了 6个尽管这6个克隆能维持several passages，但是这些细胞(iPS-MEF3) 的形态却有别于iPS-MEF4和iPS-MEF10,因为iPS-MEF3克隆有着粗糙的表面(Figure 2D)这些资料表明，Oc t3/4, c-Myc,and Klf4组合能活化Fbx15位点，但是这三个因子诱导的改变与iPS-MEF4或iPS-MEF10有区别我们运用RT-PCR去检验ES细胞标记是否在iPS细胞中表达(Figure 3 A)我们使用了能扩增转录内源性基因而 不能转录已转导基因的引物iPS-MEF10和iPS-MEF4克隆表达了除Ecatl之外的主要标记基因(Mitsui etal.,2003)包括Oct3/4在内的多个标记基因在iPS-MEF4-7, iPS-MEF10-6,和iPS-MEF10-7克隆中的表达量 要高过其他的克隆。
Sox2仅仅表达于iPS-MEF10-6中iPS-MEF4w t克隆同样表达多种ES细胞标记基因(Figure S1 )染色质免疫沉淀分析表明Oct3/4和Nanog启动子的his tone H3乙酰化增加而lysine 9of his tone H3 的二甲基化却下降了(Figure 3 B)iPS-MEF4和iPS-MEF10细胞对碱性磷酸酶和SSEA-1 (Figure 3 D)敏感， 并表现出高端粒酶活性(Figure S2)这些结果表明iPS-MEF4和iPS-MEF10与ES细胞相似，但并非完全相同在 iPS-MEF3 克隆，Ecat1, Esg1,和 Sox2 是失活的(Figure 3 A)比起 iPS-MEF4 和 iPS-MEF10 克隆，Na。