实验八实验八 鸡红细胞融合实验鸡红细胞融合实验一、实一、实 验验 目目 的的 1. 通过通过PEG介导的鸡血细胞融合实验介导的鸡血细胞融合实验, 理解理解体细胞融合原理体细胞融合原理 2. 掌握利用掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技介导动物细胞融合的实验技术，并观察细胞融合过程术，并观察细胞融合过程 二、实验原理二、实验原理•细胞融合细胞融合(cell fusion)或细胞杂交或细胞杂交(cell hybridization) 是指真核细胞通过介导和培养，两是指真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程•目前目前, 诱导细胞融合的方法有三种：病毒诱导细胞融合的方法有三种：病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG) (Pontecorvo, 1975)和电激和电激(Zimermann, 1980) •PEG能改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触能改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起两个细胞邻接位置的重排间表面张力的作用，引起两个细胞邻接位置的重排质膜在修复时相互合并在一起质膜在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟使两细胞的胞质沟通通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
从而造成相互接触的细胞之间发生融合 三、实验用品三、实验用品1 器材：器材：•离心机，水浴锅，普通光学显微镜；量筒，离心机，水浴锅，普通光学显微镜；量筒，滴管，刻度离心管，等滴管，刻度离心管，等2 材料材料 ：新鲜鸡血：新鲜鸡血 3 试剂试剂• Alsever液，葡萄糖液，葡萄糖2.05g，拧棱酸纳，拧棱酸纳0.8g，氯化纳，氯化纳0.42g加重蒸水至加重蒸水至100mL •0.85%生理盐水生理盐水 ，，• GKN液：氯化钠液：氯化钠8g，氯化钾，氯化钾0.4g，磷酸氢二钠，磷酸氢二钠1.77g，磷酸，磷酸二氢钠二氢钠0.69g，葡萄糖，葡萄糖2g，酚红，酚红0.0lg，溶于，溶于1000mL重蒸水重蒸水中•Ringer溶液：氯化钙溶液：氯化钙0.25g，氯化钾，氯化钾0.42g，氯化钠，氯化钠6.5g(恒温恒温动物动物8.5g)，溶于，溶于1000mL蒸馏水中蒸馏水中•Hanks液：氯化钙液：氯化钙0.14g（另溶解），氯化钾（另溶解），氯化钾0.4g，磷酸二氢，磷酸二氢钾钾0.06g，氯化镁，氯化镁0.10g，氯化钠，氯化钠8.0g，碳酸氢钠，碳酸氢钠0.35g，七，七水磷酸氢二钠水磷酸氢二钠0.09g，，D-葡萄糖葡萄糖1.0g，酚红，酚红0.01g。
按顺序依按顺序依次逐一完全溶解，用时氯化钙和其余混合，共计次逐一完全溶解，用时氯化钙和其余混合，共计100mL•50%PEG混合液：称取适量混合液：称取适量PEG(4000)放人刻度离心管沸水放人刻度离心管沸水浴中加热溶化，待冷却至浴中加热溶化，待冷却至50℃℃时，加入预热至时，加入预热至50℃℃的等体积的等体积的的GKN液，混匀液，混匀注意使用前配制，注意使用前配制，PGE有毒避免沾染皮肤有毒避免沾染皮肤 四、四、 实验步骤实验步骤 将将Alsever液与新鲜鸡血液与新鲜鸡血4:1混成悬液混成悬液 （抗凝效果最佳）（抗凝效果最佳） ↓ 取上述悬液按取上述悬液按 1:4 加入生理盐水混匀加入生理盐水混匀 ↓ 1500r/min，离心，离心5分钟（重复洗涤分钟（重复洗涤2次，去除细胞表面粘附物次，去除细胞表面粘附物质）质）↓弃上清弃上清 加入适量加入适量GKN液，配成细胞悬液（液，配成细胞悬液（10% ）） ↓ 取悬液以血球计数法计数取悬液以血球计数法计数 （（红细胞红细胞 15万万~20万个万个/ml，，可用可用GKN稀释稀释 ））↓ 加入加入 50%的的PEG液混匀（液混匀（1mL悬液，逐滴加入悬液，逐滴加入0.5~0.8mL预热预热的的50%PEG混匀，置于混匀，置于37℃℃水浴中温浴水浴中温浴2~10min；； ↓加加 Ringer或或Hanks终止终止 吸取吸取1~2滴镜检（加滴镜检（加0.2%次甲基蓝次甲基蓝1滴滴 ），并计算出融合率），并计算出融合率 五、五、 实验结果实验结果•经经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。
绘图说明各个时期绘图说明各个时期细胞融合后可观察到细胞融合后可观察到哪几种类型的细胞？哪几种类型的细胞？• •细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融包括已融合的细胞合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示的细胞核总数之比，通常以百分比表示多个视野计数再平均多个视野计数再平均 六、讨论六、讨论•血细胞悬液密度与融合率的关系？血细胞悬液密度与融合率的关系？•查阅近期资料，了解如何提高融合率？查阅近期资料，了解如何提高融合率？•本实验为什么用鸡血？本实验为什么用鸡血？ 。