RNA 的提取和 cDNA 合成原理和实验方法第一节 . 概述从真核生物的组织或细胞中提取 mRNA, 通过酶促反应逆转录合成 cDNA 的第一链和第二链 ,将双链 cDNA 和载体连接 ,然后转化扩增 , 即可获得 cDNA 文库 ,构建的 cDNA 文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析 ;比较 cDNA 和相应基因组 DNA 序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题总之 cDNA 的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段自 70 年代中叶首例 cDNA 克隆问世以来 ,已发展了许多种提高cDNA 合成效率的方法 ,并大大改进了载体系统，目前 cDNA 合成试剂已商品化 cDNA 合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成 cDNA 第一链 ,聚合酶合成 cDNA 第二链 ,加入合成接头以及将双链 DNA 克隆到于适当载体 (噬菌体或质粒 )一.RNA 制备模板 mRNA 的质量直接影响到 cDNA 合成的效率由于 mRNA 分子的结构特点 ,容易受 RNA 酶的攻击反应而降解 ,加上 RNA 酶极为稳定且广泛存在 ,因而在提取过程中要严格防止 RNA 酶的污染 ,并设法抑制其活性 ,这是本实验成败的关键。
所有的组织中均存在RNA 酶 ,人的皮肤、 手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套） 所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2 小时以上凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC) 水溶液处理 ,再用蒸馏水冲净 DEPC 是 RNA 酶的化学修饰剂 ,它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性 DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心试验所用试剂也可用 DEPC 处理 ,加入 DEPC 至 0.1% 浓度 ,然后剧烈振荡 10 分钟 ,再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除残存的 DEPC, 否则 DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA 活性但 DEPC 能与胺和巯基反应 ,因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用DEPC 处理 Tris 溶液可用 DEPC 处理的水配制然后高压灭菌配制的溶液如不能高压灭菌,可用 DEPC 处理水配制 ,并尽可能用未曾开封的试剂除 DEPC 外 ,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA 酶抑制蛋白等此外 ,为了避免 mRNA 或 cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经 硅烷化 处理。
细胞内总 RNA 制备方法很多 ,如异硫氰酸胍热苯酚法等许多公司有现成的总RNA 提取试剂盒 ,可快速有效地提取到高质量的总RNA 分离的总 RNA 可利用 mRNA 3'末端含有多聚 (A)+的特点 ,当 RNA 流经 oligo (dT) 纤维素柱时 ,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在 oligo(dT) 纤维素上 ,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下经过两次 oligo(dT) 纤维素柱 ,可得到较纯的mRNA 纯化的 mRNA 在 70%乙醇中 -70℃可保存一年以上二.cDNA第一链的合成所有合成 cDNA 第一链的方法都要用依赖于RNA 的 DNA 聚合酶 (反转录酶 )来催化反应目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV) 逆转录酶和从表达克隆化的Moloney 鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒 (MLV) 反转录酶 AMV 反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于 RNA 的 DNA 合成 ,依赖于 DNA 的 DNA 合成以及对 DNA:RNA 杂交体的 RNA 部分进行内切降解 (RNA 酶 H 活性 )。
MLV 反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于 RNA 和依赖于 DNA的 DNA 合成活性 ,但降解 RNADNA杂交体中的RNA 的能力较弱 ,且对热的稳定性较 AMV反转录酶差 MLV 反转录酶能合成较长的cDNA( 如大于2-3kb) AMV 反转录酶和MLV 反转录酶利用RNA 模板合成 cDNA 时的最适 pH 值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要AMV 反转录酶和 MLV 反转录酶都必须有引物来起始DNA 的合成 cDNA 合成最常用的引物是与真核细胞mRNA 分子 3'端 poly(A) 结合的 12-18 核苷酸长的 oligo(dT) 三.cDNA 第二链的合成cDNA 第二链的合成方法有以下几种 :1. 自身引导法 合成的单链 cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构 ,这就为第二链的合成提供了现成的引物 ,当第一链合成反应产物的 DNA:RNA 杂交链变性后利用大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ Klenow 片段或反转录酶合成 cDNA 第二链 ,最后用对单链特异性的 S1 核酸酶消化该环即可进一步克隆。
但自身引导合成法较难控制反应，而且用 S1 核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于 mRNA 5' 端序列出现缺失和重排 ,因而该方法目前很少使用,2. 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA 杂交链不用碱变性 ,而是在 dNTP 存在下 ,利用 RNA 酶 H 在杂交链的 mRNA 链上造成切口和缺口从而产生一系列 RNA 引物 ,使之成为合成第二链的引物 ,在大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链该反应有 3 个主要优点 : (1) 非常有效 ; (2) 直接利用第一链反应产物 ,无须进一步处理和纯化 ;(3) 不必使用 S1 核酸酶来切割双链 cDNA 中的单链发夹环 目前合成 cDNA 常采用该方法四.cDNA 的分子克隆已经制备好的双链 cDNA 和一般 DNA 一样 ,可以插入到质粒或噬菌体中 ,为此 ,首先必需连接上接头 (Linker), 接头可以是限制性内切酶识别位点片段 ,也可以利用末端转移酶在载体和双链 cDNA 的末端接上一段寡聚 dG 和 dC 或 dT 和 dA 尾巴 ,退火后形成重组质粒 ,并转化到宿主菌中进行扩增。
合成的 cDNA 也可以经 PCR 扩增后再克隆入适当载体第二节 . 动植物组织 mRNA 的提取一、材料水稻叶片或小鼠肝组织二、设备研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽三、试剂1、无 RNA 酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶 （ 180℃ 2 小时）装蒸馏水，然后加入 0.01%的 DEPC （体积 /体积），处理过夜后高压灭菌2、 75%乙醇：用 DEPC 处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制） ，然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱3 、 1×层 析 柱 加 样 缓 冲 液 ； 20mmol/LTris·Cl(pH7.6)， 0.5mol/L NaCl ， 1mmol/LEDTA(pH8.0)， 0.1% SDS4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)， 1mmol/L EDTA (pH8.0)， 0.05% SDS四、操作步骤（一）动植物总 RNA 提取 -Trizol 法Trizol 法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克用 Trizol 法提取的总 RNA 绝无蛋白和 DNA 污染。
RNA 可直接用于 Northern 斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 分离，体外翻译， RNase 封阻分析和分子克隆1、将组织在液 N 中磨成粉末后， 再以 50-100mg 组织加入 1ml Trizol 液研磨， 注意样品总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10%2、研磨液室温放置 5 分钟，然后以每 1mlTrizol 液加入 0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管 15 秒3、取上层水相于一新的离心管，按每 mlTrizol 液加 0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置 10 分钟， 12000g 离心 10 分钟4、弃去上清液，按每 ml Trizol 液加入至少 1ml 的比例加入 75%乙醇，涡旋混匀， 4℃下 7500g 离心 5 分钟5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10 分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的溶解度然后将 RNA 溶于水中，必要时可 55℃ -60℃水溶 10 分钟 RNA 可进行mRNA 分离，或贮存于 70%乙醇并保存于 -70℃[ 注意 ] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在 -70℃保存一个月以上， RNA 沉淀在 70%乙醇中可在 4℃保存一周， -20℃保存一年二） mRNA 提取由于 mRNA 末端含有多 poly(A)+ ，当总 RNA 流径 oligo(dT) 纤维素时，在高盐缓冲液作用下， mRNA 被特异的吸附在 oligo(dT) 纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中， mRNA 可被洗下，经过两次 oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的 mRNA 1、用 0.1mol/L NaOH 悬浮 0.5-1.0g oligo(dT) 纤维素2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经 DEPC 处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为 0.5-1.0ml ，用 3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床3、用 1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的 pH 值小于 8.04、将（一）中提取的 RNA 液于 65℃温育 5 分钟后迅速冷却至室温，加入等体积 2x 柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有 RNA 溶液进入柱床后，加入 1 倍柱床体积的 1x 层析柱加样溶液5、测定每一管的 OD260 ，当洗出液中 OD 为 0 时，加入 2-3 倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以 1/3 至 1/2 柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定 OD260 ，合并含有 RNA 的洗脱组分7、加入 1/10 体积的 3M NaAc(pH5.2) ， 2.5 倍体积的冰冷乙醇，混匀， -20℃ 30 分钟8、4℃下 120。