细菌自动鉴定及药敏系统的研究进展北京中医药大学东方医院检验科 陶庆春 安鹏 陈晓丹一、细菌自动鉴定及药敏系统的发展史细菌的鉴定是细菌分类的实验过程，长期以来，临床微生物实验室一直沿用 100 多年前由Gram、Pasteur、Koch、Petri 等创造的传统的微生物学鉴定方法这些传统的鉴定方法不仅过程烦琐，费时费力，且在方法学和结果的判定、解释等方面易发生主观片面而引起的错误，难以进行质量控制20 世纪 60 年代以后，微生物学家和工程技术人员密切合作，对微生物的研究采用了物理的、化学的分析方法，发明了许多自动化仪器，并根据细菌不同的生物学性状和代谢产物的差异，逐步发展了微量快速培养基和微量生化反应系统，使原来缓慢、烦琐的手工操作变得快速、简单，并实现了自动化和机械化微生物鉴定自动化方法，包括(1)临床微生物鉴定系统； (2)气液色谙分析；鉴定厌氧菌和分枝杆菌多用于研究；(3)核酸杂交；多用于研究；(4)化学发光技术；可鉴定一些细菌少数分枝杆菌属和一些真菌80 到 90 年代发展迅速，并广泛用于临床1985 年第一台自动化细菌分析仪器 Vitek-AMS 进入中国并成功使用1999 年底法国梅里埃公司推出 VITEK2 系统，从接种物稀释、密度计比较及卡冲填和封卡等步骤均实现了全自动化。
目前已有多种微生物自动鉴定及药敏测试系统问世，如VITEK-AutoMicrobicSystem(AMS)、PHOENIXTM、MicroScan、Sensititre、ABBott(MS-2 System)、AUTOBACIDXSys-tern 等这地自动化系统具有先进的微机系统，广泛的鉴定功能，适用于临床微生物实验室、卫生防疫和商检系统，主要功能包括细菌鉴定、细菌药物敏感性试验及最低抑菌浓度(MIC)的测定等其准确性和可靠性均已大大提高二、细菌自动鉴定及药敏系统原理及性能比较1.原理：临床微生物鉴定系统使细菌鉴定过程规范化和程序化，将细菌对底物的生化类型与已建立数据库类型相比较测试原理主要是利用物质产生 PH 值变化，能释放色源或荧光源复合物的酶学反应，四氮唑标记碳水化合物代谢活性的产生，挥发或非挥发酸产生，或可见生长鉴定系统反应原理 系统反应 需要生长 分析 阳性结果显示 系统例子PH 基础反应（多为 15-24 小时） 是碳源利用PH 指示剂颜色变化；利用碳源源产生酸，利用氮源产碱APICrystalVITEKMicroScan酶谱（多为 2-4 小时） 否微生物已有的酶当无色复合物被适当酶水解时，色源/荧光源释放引起颜色变化MicroScanIDS（Remel）碳源利用 是 有机产物 因转移电子至无色四唑氮标记碳源使染料变为紫色 Biolog挥发的或非挥发的酸检测 是细胞脂肪酸以检测代谢产物为基础的层析技术，与数据库中的资料相比较MIDL生长可见检测 是 不同底物 微生物利用某一底物产生浊度 酵母校菌2．采有上述原理的各种鉴定系统可鉴定肠杆菌科， 菌。
目前较完善的鉴定系统性能比较非发酵菌，革兰阳性球菌，革兰阴性球菌，厌氧菌和酵母自动鉴定系统性能比较性能 Vitek AutoSCAN-4 Walk/Away Senititre 无限 60 polor系统容量 32/60/120 无限 40/96 92 无限数据库中可鉴定菌种数566 480 需氧革兰阴性杆菌（GN）116 112 139 147 246 240 78需氧革兰阳性杆菌50 49 49 否 否 815 否厌氧菌 否 58 54 否 否 50 否苛氧菌 否 21 20 否 194 否酵母菌 36 40 42 否 GN中孵育 否 28 否分枝杆菌 否 否 否 否 手工 自动 否接种 自动 手工 手工 自动 分开 联机 自动孵育 联机 分开 联机 联机 4 或16h 30min 分开需氧革兰阴性杆菌2-18h 24 或 48h 2 或 15-42h 5 或 18h 4 或16h 30min 18-24h需氧革兰阳性球菌2-15h 24 或 48h 2 或 15-42h 30min 厌氧菌 否 4h 4h 30min 酵母菌 24 或 48h 4h 30min 分枝杆菌 否 否 否 否 手工加试剂 否 是 否 室温 4 室温 是贮存温度（℃） 4 室温，4 室温，4 室温其它性能 是 否 否 药敏试验 是 是 是 否 否 否 是尿筛检/鉴定 是 否 否 是 是 是 是DMS 是 是 是 是计算机界面 是 是 是 Biology MIS AutoSce 三、常见细菌自动鉴定及药敏系统工作原理（一）半自动微生物鉴定和药敏系统1．VITEK-ATBATB 鉴定系统是将肉眼观察的结果输入电脑，计算机数据库由许多细菌条目(taxa)组成，将输入结果与数据库内细菌条目比较，自动地得到鉴定结果。
ATB 敏感性试验采用半固体琼脂培养丛，不同的药敏试条含有不同种类的抗生素，每种抗生素都设有两个关键性的浓度，在 24 小时内通过观察有(+)无(一) 细菌生长以判断药敏试验结果结果可直接判读为：敏感，中介或耐药由读数仪和电脑两部分组成系统是由 API 金标准改良而成，拥有庞大的细菌资料库以及严格的质控，可鉴定多达 550种细菌另外，ATB 系统操作方便，只需将培养结果输入电脑，就可得到结果2．MicroScan Panel使用测试板及快速接种系统，人工判读，将编码结果输入电脑，由电脑软件得出反应结果操作简便，价格便宜3．Sensititre ManualSystem(手动装置)原理和操作方法同以上两种半自动方法二）自动微生物鉴定和药敏系统1．AutoScan-4 自动微生物鉴定／药敏分析仪试剂板在培养箱孵育，然后放主机，用比色法及比浊法对鉴定及药敏(MIC)进行测定，96 条不同波长光导纤维，对 96 孔板同时测定仪器由主机，电脑和打印机组成将菌液加入试剂板，放培养箱孵育(35～C 左右)18～24 小时将试剂板放入主机，仪器自动判读结果可同时做鉴定和药敏，自动判读结果，操作简便2．AutoReader 自动微生物鉴定／药敏分析仪用荧光检测技术，在测定板底物中加入入酶介物，使其与细菌生长中的酶结合生成荧光物质。
荧光物质通过荧光读数仪得出的生物编码（BIOCODE）来判定菌种三）Vitek-AMS（Automated Microbic System）全自动细菌鉴定和药敏分析系统工作原理1．概况：Vitek-AMS（Automated Microbic System）全自动细菌鉴定和药敏分析系统，1960 年由美国航天系统的麦克唐纳，道格拉斯公司为了鉴定宇宙环境中的微生物而研制的1973 年正式应用于临床微生物检验1989 年该系统由麦克唐纳，道格拉斯公司转让给法国生物梅里埃集团全世界有 4246 家实验室应用，国内用户 110 台1996 年资料) 自 1985 年第一台自动化细菌分析仪器 Vitek-AMS 进入中国并成功使用价格 7．8 万美元2．结构组成VITEK CC4 自动鉴定系统由菌液接种、封闭装置 (此装置分上下两部分，下部分为真空室，上部是一热切割器)．读数器、孵箱和电脑、打印机三部分组成1)充液/封口部件 这一部件分为上、下两部分上部为封口器并有切割作用，下部为真空充液接种装置将制备好菌悬液的试管和试卡用一弯形塑料管相连并置充液接种仓中，当接 Fill 钮时，即开始抽真空，真空形成后进气阀开放，仓内形成负压，菌液从试管通过弯形塑料管进入试卡内即完成接种，上部封口为一热切割器，温度可升至 200℃以上，完成按种的试卡可置热切割器中，密闭并切割平整。
2)孵箱／读数器 孵箱内有一直立圆形转盘，每隔 900 置一卡片架，每个孵箱共可放 4 个卡片架，每一个卡片架分别用 A、B、C、D 标记，每—卡片架可放 32 张测试卡孵箱直接由计算机控制，读数器是 665nm 波长的光扫描器，每 15min 自动扫描一次，并将光信号转换为电信号传送至计算机3)计算机、终端和键盘 计算机就像整个系统的神经中枢，始终保持与孵箱／读数器、打印机和终端的联络，控制孵箱温度，自动定时读数，收集记录，储存和分析资料当卡片反应完成时，计算机可指示打印机自动打印报告使用者可随时从终端查询试卡检测结果，配有 IMS 装置的计算机还具有数据统计功能，该系统计算机还可同时带动两个孵箱／读数器并可与自动免疫诊断系统——VIDAS 联用终端是由 21cm 彩色显像管组成终端可提供人机对话并与各部件联络，当系统出现故障会自动报警键盘为 102 标准键擞，通过键盘可建立适合各类实验室的框架输入指令或菜单，控制系统的运动状态，输入各检测样本的流行病学资料4)打印机 打印机始终与计算机保持联络，接受计算机发出的命令，自动打印每一试卡的最终报告，包括实验室保留的 short report 和发给临床医生的 patient report，并自动打印系统出现的故障资料。
3．原理(1)鉴定原理：常规革兰刚(阴)性板对各项生化反应结果(阴性或阳性) 的判定是根据比色法的原理，将菌种接种到鉴定板后进行培养，由于细菌各自的酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又具有不同的生化特性，因此各生化反应的颜色变化各不相同仪器自动每隔 1 小时测定每—生化反应孔的透光度，当生长对照孔的透光度达到终点阈值时，指示已完成反应由光电技术、电脑技术和细菌八进位制数码鉴定相结合每个鉴定卡内含有 30 项生化反应，每 3 项为一组，各确立阳性反应值为1、2、4：如 3 项反应全部阳性，其组值为 7；如第 1、2 项反应阳性，其组值为 3；第 1、3 项反应阳性，其组值为 530 项生化反应可获得 10 位数的生物数码，在鉴定时有时还需外加补充试验，共可获得 11 位生物数码，系统将其最后一次判读的结果所得生物数码与菌种资料库标准菌生物模型相比较，得到鉴定值和鉴定结果，并自动打印出实验报告和发给病人的病房报告2)药敏实验原理药敏测试板(卡)的药物敏感性试验实质是微型化的肉汤稀释试验应用光电比浊原理，根据不同的药物对不同的菌最低抑菌浓度不同，每一种药物一般选用 3 种不同药物浓度，每一药敏试卡可同时作 10 种药物的 MIC(minimal inhibitory concentration)测定，经 6 小时孵育后，每隔一定时间自动测定小孔中细菌生长状况，即可得到待测菌在各浓度的生长率。
待检菌斜率与阳性对照孔斜率之比值，经回归分析得到 MIC 值，并根据 NCCLLS(美国国家临床实验室标准化委员会)标准获得相应的 S、I 和R 结果药敏报告含 MIC 值，敏感度，药物一次剂量和在该剂量下的血清和尿液内最高药物浓度4．主要操作步骤(1)光电比浊仪革兰氏阳性菌配制相当 0.5 麦氏管菌悬液，革兰氏阴性菌配制相当 1 麦氏管菌悬液、酵母菌配制相当 2 麦氏管菌悬液，厌氧菌配制相当大于 2 麦氏管菌悬液2)菌液接种和封闭(3)卡片装入读数器／孵箱4)输入病人人口统汁学资料5)自动打印实验室和病人报告5．系统功能和特点(1)鉴定功能系统具有对不同菌类的鉴定能力，含有鉴定试卡十种，包括A．GNI 卡(革兰氏阴性杆菌)：可鉴定肠道菌和非发酵菌 117 种B．GPI 卡 (革兰氏阳性球菌)：可鉴定葡萄球菌、链球菌及其他细菌 49 种C．YBC 卡(酵母菌 )：可鉴定酵母样真菌 36 种D．BAC 卡( 需养芽孢杆菌)：可鉴定芽孢杆菌 12 种E．ANI 卡(厌氧菌)：可鉴定 87 种F．NIH 卡(奈瑟氏菌、嗜血杆菌)：可鉴定奈瑟氏菌、嗜血杆菌和其它苛氧菌 30 种G．NFC 卡(非发酵型革兰氏阴性细菌)：可鉴定非发酵型革兰氏阴性细菌。
H．GNI+卡：快速革兰氏阴性菌鉴定卡筛选卡L．UID-3 卡：尿道感染专用鉴定和。