Library construction试剂试剂 50*TAE 存储液，存储液，PH 约 8.5： 242g Tris 碱 57.1ml 冰醋酸 37.2gNa2EDTA.2H2O 加 H2O 至 1000ml 1*TAE: 200ml 50*TAE 加 H2O 至 10000ml 乙酸钠，乙酸钠，3mol/l存储于 4C 将 40.8gNaAc.3H2O 溶于水，用乙酸调至 PH5.2 补加水至 100ml 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）） ，10mg/ml 在 20mlH2O 中溶解 0.2g 溴化乙锭，均匀后于室温避光保存 1%盐酸盐酸 300ml 浓盐酸，加 H2O 至 10000ml第一日第一日 配胶配胶 配置一板 1%琼脂糖凝胶超声超声 1、 取 4-5ug DNA 入 1.5mlEpperdorf 管中，共 4 支 2、 4 管 DNA 分别超声 4 秒、8 秒、14 秒、20 秒（其中 8、14、20 秒分多个相同时间段 进行，间歇时间为 10 秒，超声时应将变幅杆居中并伸入液面 3mm） 3、 各取 10ul 加入 2ul 6*loading buffer，上样电泳（1%琼脂糖凝胶） ，至溴芬蓝泳动 7cm，拍照，观察超声效果，8、14 秒超声管的 DNA 片断量应以 1.6-3.0kb 处最多， 而超声时间 4、20 秒的 DNA 片段量应以分别在 4-10kb 和 1-1.6kb 处最多 4、 根据电泳结果，对个别超声效果欠佳的样品要再次超声，具体时间应根据实际效果 而定 注：请详细填写建库组工作日程表纯化纯化 5、 每管加 1/10 体积的 3MnaAc 和 2 倍体积预冷无水乙醇，-200C 30min 6、 离心：13000rpm,10min。
（室温，利于 DNA 沉淀） ，去上清 7、 各管加 1ml 70% 乙醇，颠倒数次 8、 离心：13000rpm,5min 9、 弃上清，离心机甩一下，吸去上清，置室温 15min 以使酒精挥发干净 10、每管加 20ul 无菌纯水溶解 DNA，收集四管中的样品于一管末端补平末端补平 11、如下表所示，在 DNA 样品种一次添加下列各试剂DNA80ul H2O3ul 10*Buffer10ul dNTP(10mM)2ul T4Polymerase(5u/ul)5ul Total100ul 充分混匀，离心机甩一下 12、置 370C 水浴 1 小时 （50ul 30min） 13、从水浴取出后，加 50ul 酚/氯仿（等体积） ，充分混匀至乳白色 离心：4C,13000rpm,15min 14、吸上清至另一干净离心管中，加 200ul 氯仿，充分混匀至乳白色 离心：4C,13000rpm,10min（2-3 分钟时停下，抽出氯仿，继续离心 12min） 15、吸上清至另一干净离心管中，加 20ul 6*loading buffer，离心机中甩一下，使样品 集中于管底，40C 过夜第二日第二日 配胶配胶 1、 配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶. 配制大胶数半板（每个样品一半板）：1%琼脂糖凝胶. 电泳电泳 1、 取 4C 保存样品上样，50ul/孔 2、 电泳 60V；3hr（溴酚蓝距点样孔 7cm） 。
3、 分别切下 1.6-2.0kb、2.0-2.5kb 及 2.5-3.0kb DNA 片段，反向（大片段的一边靠前）放 入二次回收胶的加样孔中 （在家样孔中先加满 0.5%低熔点琼脂糖凝胶） 4、 电泳 150V，2hr（溴酚蓝距点样孔） 5、 紫外灯下依次切取含 DNA 片段的胶，分别放入已做标记的 1.5ml 离心管中回收回收 6、 用 QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒从胶中回收 DNA 片段 1） 称取胶重，加入三倍体积 buffer QXI（例如，100mg 胶中加入 300ul buffer QXI） 2） 50C 水浴数分钟，至胶完全融化用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入 5ul QIAEXII 3） 50C 水浴 10min，每隔 2min 取出颠倒混匀数次，使 QIAEX II 保持悬浮 4） 4C，13000rpm，30sec （弃上清，离心机中甩一下，吸取上清） 5） 加入 500ul buffer QXI，弹管底使 QIAEX II 重悬 6） 离心并去上清（同操作 4） 7） 加入 500ul buffer PE，重悬 QIAEX II，离心 30sec，去上清 8） 在加入 500ul buffer PE，重悬 QIAEX II，离心 30sec，弃上清，离心机中甩一下， 吸去上清 9） 超净台上吹干（至无酒精味） ，加入 10ul elution buffer，重悬 QIAEX II，静置 5min，13000rpm，30sec。
吸上清，冰浴 7、 取 1ul 上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及 DNA 含量标准 （20ng，40ng）对照 8、 据电泳结果，取适量 DNA 进行连接连接连接 9、 在一 0.5ml 离心管中，依次加入下列物质 Insert (DNA 样品)xul (80-100ngDNA) H2O(7-x)ul Ligase buffer (10*)1ul Vector (30ng/ul)1ul T4DNA ligase (3u/ul)1ul Total10ul 10、140C 连接过夜（12-16 小时） 纯化纯化 将连接产物放于漂在水面上的 millinpor 的纯化膜上,静置 1.5 小时.吸出放于 1.5ml 的离心管 中.电转化电转化1.于-70 ℃冰箱内取感受态细胞置于冰上融化，用预冷好的灭菌水轻轻注入并吹打混匀 (冰上操作)，0 ℃，6000 rpm，8 min 离心2.吸取上清并弃之，取灭菌水补至所需体积(冰上操作)，混匀3.取 2 μl 纯化后得质粒，加入 100 感受态细胞中，混匀(冰上)4.打开细胞导入仪，调至 Manual，调电压为 2.1KV5.将加有连接产物的菌液加入到 0.1cm2的电击杯中, 进行电穿孔。
6.按一下 pulse 键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入 1000μl 的 SOC 液体培养基，转 移到 1.5ml 的离心管中7．于 70 rpm，37℃摇床，复苏 45—60 分钟，同时做阴性对照和阳性对照 注：在此条件下，细胞的浓度较静置条件下细胞浓度高，因此，细胞分裂减少[4]涂板及菌液培养涂板及菌液培养1.取 30 μl 菌液加入 170 μl LB 液体,共计 200 μl 涂在直径 12cm 的涂有 X- Gal、IPTG、Amp 的平板上, 37 ℃培养 18 小时左右取出后，观察白/兰斑情况，并记 录2. 取 30 μl 菌液加入 5ml 2 x YT 培养基中做液体培养，于 37℃，250rpm 摇 12-14 个 小时，观察菌液生长情况（排除噬菌体污染） ，并记录注：每块加有 Amp 的平板上涂有 X-Gal、IPTG 比例为：X-Gal 为 50 μl +50 μl LB 液体， IPTG 为 12 μl 涂均匀。