激光动态光散射仪操作手册一、动态光散射仪的工作原理动态光散射技术（dynamiclightscattering,DLS）是指通过测量样品散射光强度起伏的变化来得出样品颗粒大小信息的一种技术之所以称为“动态”是因为样品中的分子不停地做布朗运动，正是这种运动使散射光产生多普勒频移动态光散射技术的工作原理可以简述为以下几个步骤：首先根据散射光的变化，即多普勒频移测得溶液中分子的扩散系数D,再由D二KT/6nnr可求出分子的流体动力学半径r，（式中K为玻尔兹曼常数，T为绝对温度，n为溶液的粘滞系数）,根据已有的分子半径-分子量模型，就可以算出分子量的大小光在传播时若碰到颗粒，一部分光会被吸收，一部分会被散射掉如果分子静止不动，散射光发生弹性散射时，能量频率均不变但由于分子不停地在做杂乱无章的布朗运动，所以，当产生散射光的分子朝向监测器运动时，相当于把散射的光子往监测器送了一段距离，使光子较分子静止时产生的散射光要早到达监测器，也就是在监测器看来散射光的频率增高了；如果产生散射的分子逆向监测器运动，相当于把散射光子往远离监测器的方向拉了一把，结果使散射光的频率降低日常生活中，但我们听到救护车由远而近时，声音的频率越来越高，也是同样的道理。
实际上我们可以根据声音频率变化的快慢来判断救护车运动的速度光散射技术就是根据这种微小的频率变化来测量溶液中分子的扩散速度由D=KT/6nnr可知，当扩散速度一定时，由于实验时溶剂一定，温度是确定的,所以扩散的快慢只与流体动力学半径有关蛋白质多方面的性质都直接和它的大小相关因此，光散射广泛应用与蛋白质及其它大分子的理化性质研究动态光散射技术的优点：1．样品制备简单，不需特殊处理，测量过程不干扰样品本身的性质，所以能够反映出溶液中样品分子的真实状态；2．测量过程迅速，而且样品可以回收利用；3.检测灵敏度高，10kD蛋白质，浓度只需0.1mg/mL，样品体积只需20-50乩即可;4．能够实时监测样品的动态变化二、动态光散射技术的应用溶液中的颗粒物质（如生物大分子、高分子聚合物、胶束等），其颗粒大小的变化往往可以反应出某些性质方面的变化由于光散射实际上是首先通过测量大分子物质的扩散系数，进而推导出其它参数所以，光散射不仅可以用来进行静态测量，还可以检测一些动态过程的变化下面以大家熟悉的生物学中的几个具体实例来介绍动态光散射技术的应用1. 测定蛋白质分子的均一性蛋白质样品的均一性是生长晶体的前提条件，在无法直接观察蛋白质在溶液中状态的情况下，生长晶体是一个需要经验和运气的过程。
但是用光散射技术，只需要几分钟就可以确切地告诉你，这个样品是否有长出晶体的可能性你还可以测定蛋白在不同溶液中的状态，从而确定出哪种溶液最适合生长晶体2•测定蛋白质分子的pH稳定性有些蛋白质分子在不同的pH值条件下，会有不同的构型，或者形成聚合态，或是变性如胰岛素在pH2.0时是以单体存在，而在pH3.0时则以二聚体形式存在，当pH升至7.0时则以六聚体存在因为这种变化表现为大小的变化，所以光散射技术可以用来测定蛋白质分子的pH稳定性3. 测定蛋白质分子的热稳定性对一些热不稳定的蛋白，温度改变会导致分子变性聚合，因此可以观察到分子半径明显增大所以可以利用光散射技术来研究蛋白质分子的热稳定性4. 蛋白质变复性及折叠的研究蛋白质变性时往往是以聚合形式或较松散的状态存在，复性后，蛋白质折叠成天然状态，会发生结构的变化，这一变化可以导致流体动力学半径的变化，所以光散射技术可以用来检测这一动态变化的过程5. 临界胶束浓度的测定一定浓度的表面活性剂分子加到溶液中会形成微胶束，但浓度不同会影响胶束的大小以及是否能够形成胶束如果浓度增加到一定程度，胶束就会形成，胶束的大小和单分子大小会有明显区别，利用光散射就可以确定胶束形成的临界浓度。
动态光散射技术还可用于一些动态过程的检测，譬如蛋白质复性的整个过程的监测三、激光动态光散射仪的结构动态光散射仪的结构原理图如下：仪器结构总是与其功能相适应的，下图为生命科学学院所有的proteinsolution公司的MS800光散射仪的外形上方为主机，包括激光器、检测器、相关器等；下方是温控器和样品室FBbtftiptieCubitsMiliisiyCabJeUSDCableDynaProHastUantMkroSaniplETDiodelaserAFDCorrdulor羽bilA-t?L'O12VpowersupplyConigjtiter'williDYNAMICSV6RS232D«vi9L^intcliOpticRccch-crOplkCellChamberExtenbd冲训叫中邂a]Devices/bbl.CO其详细的结构示意图如下:RS232CiLblcOptiiMwdTmqjciHiLircChiUtdI：Moctule!U帼骷窜蛙甲灯迦诧CtnaicB'iTIWMo血JPg<^BiriddinSiirPad四、动态光散射仪的使用1、样品制备由于动态光散射仪对灰尘和气泡及其它大的颗粒非常敏感，所以制备样品时，一定要注意不要让样品中混有大颗粒物质。
一般采取如下措施：a）先将样品离心，12000g离心5分钟，离心时的温度视样品要求而定取上层样品过滤，滤膜的选择要视样品分子大小而定，对蛋白质样品通常用0.02ym的滤膜，如果目标分子在100kD以上，建议用0.1ym的滤膜过滤后的样品直接加样到样品室中加样步骤将加样针伸到样品池的底部，一边加样一边缓缓向上提起加样针，以免形成气泡，然后盖上样品池的盖子注意，加样针不能碰到样品池的窗口，否则会留下划痕，影响测量1）样品池的清洗与准备2）动态光散射技术非常灵敏，所以对每一个细节的要求都很高样品池的内外表面不能粘有脏物，不能有手指印迹等3）清洗步骤：用1％tritonX－100浸泡，超声清洗十分钟，然后用超纯水冲洗干净，再用高纯氮气吹干检测是否洗干净的方法是装上超纯水，进行光散射测量，看散射光强是否与标准值接近清洗干净的样品池保存在专用的盒子中备用3、数据分析与解释*PolydispersityCPv15%ofRH®均一（如下图上排所示）注意：均一并不说明一定是单体，下图上排三种情况均是均一状态CPv30%ofRH®（如下图下排左一所示）CP>30%ofRH®（如下图下排左二、三所示）Pahdivprrw^lodainndaLMuntMjir4p*r>rKbnudjilFrfclvdhjwnfIfiLiHKial^iQarMlhfiprnif五、实验步骤1、打开计算机，打开光散射仪电源；2、运行DynamicV6程序，将温度设定在所需的值，并待其温度稳定；3、装配过滤器，滤膜孔径为0.02ym。
将100ul配制好的蛋白质溶液12000rpm离心5分钟，取上层样品40微升，过滤上样4、新建实验窗口，从file菜单中选择new或在主界面直接点击new快捷；5、输入相应的参数和文件名，参数包括；溶剂类型，采集数据的时间，温度，样品浓度，所选理论模型等；6、将盛放好样品的样品池放到样品室中，盖上样品室盖子；7、点击record按钮，采集数据；8、收集十组以上有用数据，分析实验结果；注意，样品池用过之后，下一次上样之前，必须清洗干净，判断方法是在样品池中加入过滤后的超纯水，看所测结果是否符合标准六、注意事项仪器中光路系统的干燥管需要定期检查，如果吸潮到一定程度，需要烘干再生实验流程开机及打开软件设置参数（包括温度，激光强度，分子结构模型）将样品放到散射池中将散射池放到样品室中等五分钟，待温度平衡采集数据检测数据采集保存数据如果数据较好，分析粒径分布采样结束，取出散射池清理散射池，装载下一个样品采集数据重复测试其它样品或终止实验推出软件（必须在关闭仪器电源之前）关闭电源操作流程图示—一・・・r・开启电源打开软件w^v^.bbioo.cov?DynamicsV6.Ink1.打开仪器两部分的电源2.双击打开DytiamicsV6软件软件操作部分1、新建一个文件2、点击右下的connect，建立软件与仪器的连接;3、连接成功后，startbutton会变成绿色。
4、装载样品，点击startbutton,即可开始采集数据数据采集时，startbutton为红色，点击红色的startbutton即可停止数据采集建议：1］第一次上样建议用未过滤的样品，最小上样体积12微升把加样针的前端伸到样品池的底部，加样时缓慢将上样针上提，避免气泡产生2］如果采集的数据表明样品有聚集或者有大的颗粒，可将样品进行离心(15000g,10min)，或者将样品进行过滤处理当样品池放好，点击绿色startbutton按钮，采集数据如果按钮不是绿色，表明计算机没有和仪器连接起来；采集十组有效数据以上，停止采集数据5、数据的自动采集，DY\AMK5¥6-PSA-.Iy
7、数据保存点击file-save,或点击save按钮保存文件8、数据分析处理通过软件对采集的数据进行分析处理。