生物化学与分子生物学专业优秀论文生物化学与分子生物学专业优秀论文 人泛素基因原核表达载体的人泛素基因原核表达载体的构建、表达及鉴定构建、表达及鉴定关键词：泛素基因关键词：泛素基因 基因克隆基因克隆 原核表达原核表达 酶活性酶活性 分子生物学分子生物学 mRNAmRNA 序列序列摘要：泛素(Ubiquitin，Ub)是一个由 76 个氨基酸组成的高度保守的多肽链 它在细胞中以非共价键方式或通过共价键与蛋白质牢固结合主要功能是参与 蛋白质降解，通过介导蛋白降解、改变蛋白的细胞定位、改变蛋白的酶活性、 改变蛋白与蛋白的相互作用等方式影响其所结合蛋白的功能与活性而蛋白质 降解异常又与许多疾病的发生密切相关随着医学分子生物学技术的进步，人 们已经从分子机制上认识和讨论它们之间的关系近年来泛素及其类似物已经 成为了分子生物学的研究热点之一 本试验根据 GenBank 中已发表的人泛素 基因 mRNA 序列，借助 Primer5.0 设计了六对寡核苷酸引物，运用引物搭桥法合 成目的序列 Ub在克隆出人泛素基因(Ub)的基础上，构建原核表达载体 pGEX- 4T-Ub 并对 Ub 基因进行了原核表达和纯化，为进一步研究其功能奠定了基础。
研究结果如下： 1．根据 GenBank(登陆号：M17524)中公布的人泛素基因(Ub)序 列设计特异性引物，用引物搭桥法进行 PCR 扩增，获得 228bp 的 DNA 片段 2．利用定向克隆的方法，以 pGEX-4T-1 为载体，利用 BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ酶切位 点，将纯化的基因 Ub 克隆至 pGEX-4T-1 中，构建了原核表达载体 pGEX-4T- Ub经酶切鉴定筛选出阳性克隆，进一步的序列分析确认了其中 Ub 序列的正确 性 3．将原核表达质粒 pGEX-4T-Ub，转化至 E．coli BL21(DE3)pLysS 感 受态细胞中，经 IPTG 诱导后 SDS-PAGE 分析，在约 35 kD 处出现了与预期目的 蛋白相一致的外源蛋白带 4．Western blot 分析重组蛋白，在目的蛋白相 应位置出现了特异性的染色条带，这表明所表达的重组蛋白是人泛素蛋白正文内容正文内容泛素(Ubiquitin，Ub)是一个由 76 个氨基酸组成的高度保守的多肽链它 在细胞中以非共价键方式或通过共价键与蛋白质牢固结合主要功能是参与蛋 白质降解，通过介导蛋白降解、改变蛋白的细胞定位、改变蛋白的酶活性、改 变蛋白与蛋白的相互作用等方式影响其所结合蛋白的功能与活性。
而蛋白质降 解异常又与许多疾病的发生密切相关随着医学分子生物学技术的进步，人们 已经从分子机制上认识和讨论它们之间的关系近年来泛素及其类似物已经成 为了分子生物学的研究热点之一 本试验根据 GenBank 中已发表的人泛素基 因 mRNA 序列，借助 Primer5.0 设计了六对寡核苷酸引物，运用引物搭桥法合成 目的序列 Ub在克隆出人泛素基因(Ub)的基础上，构建原核表达载体 pGEX-4T- Ub 并对 Ub 基因进行了原核表达和纯化，为进一步研究其功能奠定了基础研 究结果如下： 1．根据 GenBank(登陆号：M17524)中公布的人泛素基因(Ub) 序列设计特异性引物，用引物搭桥法进行 PCR 扩增，获得 228bp 的 DNA 片段 2．利用定向克隆的方法，以 pGEX-4T-1 为载体，利用 BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ酶切位 点，将纯化的基因 Ub 克隆至 pGEX-4T-1 中，构建了原核表达载体 pGEX-4T- Ub经酶切鉴定筛选出阳性克隆，进一步的序列分析确认了其中 Ub 序列的正确 性 3．将原核表达质粒 pGEX-4T-Ub，转化至 E．coli BL21(DE3)pLysS 感 受态细胞中，经 IPTG 诱导后 SDS-PAGE 分析，在约 35 kD 处出现了与预期目的 蛋白相一致的外源蛋白带。
4．Western blot 分析重组蛋白，在目的蛋白相 应位置出现了特异性的染色条带，这表明所表达的重组蛋白是人泛素蛋白 泛素(Ubiquitin，Ub)是一个由 76 个氨基酸组成的高度保守的多肽链它在细 胞中以非共价键方式或通过共价键与蛋白质牢固结合主要功能是参与蛋白质 降解，通过介导蛋白降解、改变蛋白的细胞定位、改变蛋白的酶活性、改变蛋 白与蛋白的相互作用等方式影响其所结合蛋白的功能与活性而蛋白质降解异 常又与许多疾病的发生密切相关随着医学分子生物学技术的进步，人们已经 从分子机制上认识和讨论它们之间的关系近年来泛素及其类似物已经成为了 分子生物学的研究热点之一 本试验根据 GenBank 中已发表的人泛素基因 mRNA 序列，借助 Primer5.0 设计了六对寡核苷酸引物，运用引物搭桥法合成目 的序列 Ub在克隆出人泛素基因(Ub)的基础上，构建原核表达载体 pGEX-4T-Ub 并对 Ub 基因进行了原核表达和纯化，为进一步研究其功能奠定了基础研究结 果如下： 1．根据 GenBank(登陆号：M17524)中公布的人泛素基因(Ub)序列 设计特异性引物，用引物搭桥法进行 PCR 扩增，获得 228bp 的 DNA 片段。
2．利用定向克隆的方法，以 pGEX-4T-1 为载体，利用 BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ酶切位 点，将纯化的基因 Ub 克隆至 pGEX-4T-1 中，构建了原核表达载体 pGEX-4T- Ub经酶切鉴定筛选出阳性克隆，进一步的序列分析确认了其中 Ub 序列的正确 性 3．将原核表达质粒 pGEX-4T-Ub，转化至 E．coli BL21(DE3)pLysS 感 受态细胞中，经 IPTG 诱导后 SDS-PAGE 分析，在约 35 kD 处出现了与预期目的 蛋白相一致的外源蛋白带 4．Western blot 分析重组蛋白，在目的蛋白相 应位置出现了特异性的染色条带，这表明所表达的重组蛋白是人泛素蛋白 泛素(Ubiquitin，Ub)是一个由 76 个氨基酸组成的高度保守的多肽链它在细 胞中以非共价键方式或通过共价键与蛋白质牢固结合主要功能是参与蛋白质 降解，通过介导蛋白降解、改变蛋白的细胞定位、改变蛋白的酶活性、改变蛋 白与蛋白的相互作用等方式影响其所结合蛋白的功能与活性而蛋白质降解异常又与许多疾病的发生密切相关随着医学分子生物学技术的进步，人们已经 从分子机制上认识和讨论它们之间的关系。
近年来泛素及其类似物已经成为了 分子生物学的研究热点之一 本试验根据 GenBank 中已发表的人泛素基因 mRNA 序列，借助 Primer5.0 设计了六对寡核苷酸引物，运用引物搭桥法合成目 的序列 Ub在克隆出人泛素基因(Ub)的基础上，构建原核表达载体 pGEX-4T-Ub 并对 Ub 基因进行了原核表达和纯化，为进一步研究其功能奠定了基础研究结 果如下： 1．根据 GenBank(登陆号：M17524)中公布的人泛素基因(Ub)序列 设计特异性引物，用引物搭桥法进行 PCR 扩增，获得 228bp 的 DNA 片段 2．利用定向克隆的方法，以 pGEX-4T-1 为载体，利用 BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ酶切位 点，将纯化的基因 Ub 克隆至 pGEX-4T-1 中，构建了原核表达载体 pGEX-4T- Ub经酶切鉴定筛选出阳性克隆，进一步的序列分析确认了其中 Ub 序列的正确 性 3．将原核表达质粒 pGEX-4T-Ub，转化至 E．coli BL21(DE3)pLysS 感 受态细胞中，经 IPTG 诱导后 SDS-PAGE 分析，在约 35 kD 处出现了与预期目的 蛋白相一致的外源蛋白带。
4．Western blot 分析重组蛋白，在目的蛋白相 应位置出现了特异性的染色条带，这表明所表达的重组蛋白是人泛素蛋白 泛素(Ubiquitin，Ub)是一个由 76 个氨基酸组成的高度保守的多肽链它在细 胞中以非共价键方式或通过共价键与蛋白质牢固结合主要功能是参与蛋白质 降解，通过介导蛋白降解、改变蛋白的细胞定位、改变蛋白的酶活性、改变蛋 白与蛋白的相互作用等方式影响其所结合蛋白的功能与活性而蛋白质降解异 常又与许多疾病的发生密切相关随着医学分子生物学技术的进步，人们已经 从分子机制上认识和讨论它们之间的关系近年来泛素及其类似物已经成为了 分子生物学的研究热点之一 本试验根据 GenBank 中已发表的人泛素基因 mRNA 序列，借助 Primer5.0 设计了六对寡核苷酸引物，运用引物搭桥法合成目 的序列 Ub在克隆出人泛素基因(Ub)的基础上，构建原核表达载体 pGEX-4T-Ub 并对 Ub 基因进行了原核表达和纯化，为进一步研究其功能奠定了基础研究结 果如下： 1．根据 GenBank(登陆号：M17524)中公布的人泛素基因(Ub)序列 设计特异性引物，用引物搭桥法进行 PCR 扩增，获得 228bp 的 DNA 片段。
2．利用定向克隆的方法，以 pGEX-4T-1 为载体，利用 BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ酶切位 点，将纯化的基因 Ub 克隆至 pGEX-4T-1 中，构建了原核表达载体 pGEX-4T- Ub经酶切鉴定筛选出阳性克隆，进一步的序列分析确认了其中 Ub 序列的正确 性 3．将原核表达质粒 pGEX-4T-Ub，转化至 E．coli BL21(DE3)pLysS 感 受态细胞中，经 IPTG 诱导后 SDS-PAGE 分析，在约 35 kD 处出现了与预期目的 蛋白相一致的外源蛋白带 4．Western blot 分析重组蛋白，在目的蛋白相 应位置出现了特异性的染色条带，这表明所表达的重组蛋白是人泛素蛋白 泛素(Ubiquitin，Ub)是一个由 76 个氨基酸组成的高度保守的多肽链它在细 胞中以非共价键方式或通过共价键与蛋白质牢固结合主要功能是参与蛋白质 降解，通过介导蛋白降解、改变蛋白的细胞定位、改变蛋白的酶活性、改变蛋 白与蛋白的相互作用等方式影响其所结合蛋白的功能与活性而蛋白质降解异 常又与许多疾病的发生密切相关随着医学分子生物学技术的进步，人们已经 从分子机制上认识和讨论它们之间的关系。
近年来泛素及其类似物已经成为了 分子生物学的研究热点之一 本试验根据 GenBank 中已发表的人泛素基因 mRNA 序列，借助 Primer5.0 设计了六对寡核苷酸引物，运用引物搭桥法合成目 的序列 Ub在克隆出人泛素基因(Ub)的基础上，构建原核表达载体 pGEX-4T-Ub 并对 Ub 基因进行了原核表达和纯化，为进一步研究其功能奠定了基础研究结果如下： 1．根据 GenBank(登陆号：M17524)中公布的人泛素基因(Ub)序列 设计特异性引物，用引物搭桥法进行 PCR 扩增，获得 228bp 的 DNA 片段 2．利用定向克隆的方法，以 pGEX-4T-1 为载体，利用 BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ酶切位 点，将纯化的基因 Ub 克隆至 pGEX-4T-1 中，构建了原核表达载体 pGEX-4T- Ub经酶切鉴定筛选出阳性克隆，进一步的序列分析确认了其中 Ub 序列的正确 性 3．将原核表达质粒 pGEX-4T-Ub，转化至 E．coli BL21(DE3)pLysS 感 受态细胞中，经 IPTG 诱导后 SDS-PAGE 分析，在约 35 kD 处出现了与预期目的 蛋白相一致的外源蛋白带。
4．Western blot 分析重组蛋白，在目的蛋白相 应位置出现了特异性的染色条带，这表明所表达的重组蛋白是人泛素蛋白 泛素(Ubiquitin，Ub)是一个由 76 个氨基酸组成的高度保守的多肽链它在细 胞中以非共价键方式或通过共价键与蛋白质牢固结合主要功能是参与蛋白。