1厚朴酚与和厚朴酚抗肿瘤作用研究进展【关键词】 厚朴酚；和厚朴酚；肿瘤；综述厚朴酚(magnolol,MG)与和厚朴酚(honokiol,HK)是我国传统中药厚朴的两个主要活性成分,具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、肌肉松弛、降胆固醇和抗衰老等广泛的药理作用笔者就 MG与 HK的抗肿瘤作用和作用机制的研究进展综述如下1 诱导肿瘤细胞凋亡细胞凋亡是在特定时空发生的、受机体严密调控的细胞自杀现象选择性诱导细胞凋亡已成为治疗恶性肿瘤的基本策略许多实验发现：MG 和 HK有诱导多种肿瘤细胞凋亡的作用如：MG 能诱导人鳞状细胞肺癌 CH27细胞[1]、人 HL-60细胞和白血病 Jurkat T细胞[2]、黑色素瘤 B16-BL6细胞、人结肠癌 COLO-205和人肝细胞癌 Hep-G2细胞[3]以及人宫颈癌 HeLa细胞[4]的凋亡,作用呈时间和剂量依赖性,而并不诱导中性粒细胞和外周血单核细胞的凋亡[2],对人正常胚肺 HEL299细胞的细胞毒作用弱于 HeLa细胞[4]HK 能诱导人淋巴样白血病Molt 4B细胞株[5]、CH27 细胞[6]、慢性 B淋巴细胞性白血病(B-CLL)细胞[7]和人结直肠癌 RKO细胞株[8]凋亡,作用呈剂量和时间依赖性,对 B-CLL细胞的毒性大于正常的单核细胞[7]。
caspase家族是一类半胱氨酸蛋白酶,能特异性裂解天冬氨酸后的蛋白残基,在细胞凋亡的信号传导中起重要作用迄今为止已发现 14种 caspase,其中 7种和凋亡有关,分为两类：一类是上游或启动 caspase(包括 caspase-2,-8,-9,-10)；一类是下游或效应 caspase(包括 caspase-3,-6,-7)在体外增殖实验中,100 mmol/L MG 24 h能诱导 B16-BL6、THP-1 和 HT-1080细胞凋亡(但对 BAE细胞株无效),继而上调 caspase-3和 caspase-8活性[9]100 mmol/L MG 上调 caspase活性的作用可被 caspase家族抑制剂 z-VAD-fmk所抑制提示 MG肿瘤生长是通过激活 caspase而诱导细胞凋亡起作用的在 MG诱导人 HL-60细胞和白血病Jurkat T细胞凋亡的实验中发现,caspase-9、caspase-3 和 caspase-2被激活及聚 ADP核糖聚合酶(PARP)蛋白分解性剪切PARP,即 poly(ADP-ribose) polymerase,在体外可以被多种 caspase剪切,在体内是 caspase-3的主要剪切对象。
被剪切后的 PARP失去其酶活力PARP 对于细胞的稳定和存活非常重要,PARP失去酶活力会加速细胞的不稳定PARP 剪切被认为是细胞凋亡的一个重要指标,也通常被认为是 caspase-3激活的指标caspase 家族抑制剂和 caspase-9选择性抑制剂能阻止 MG诱导的细胞凋亡,caspase-3 和 caspase-2抑制剂能部分抑制凋亡[2]在 MG诱导人鳞状细胞肺癌 CH27细胞凋亡实验中,MG 能导致caspase-9、caspase-3 和 caspase-6的激活用 z-VAD-fmk预处理可显著抑制MG诱导的细胞凋亡[1]caspase-3,-8,-9,-10 抑制剂及 caspase家族抑制剂可明显抑制 MG诱导的人宫颈癌 HeLa细胞凋亡80 μmol/L MG作用于 HeLa细胞12 h后 caspase-3前体被降解,即产生活化的 caspase-3；同时, caspase-3底物 ICAD(inhibitor of caspase dependent DNase)和 PARP被剪切,进一步表明MG诱导的 HeLa细胞凋亡时激活了 caspase-3caspase-3 位于 caspase级联反2应的下游,是细胞死亡的执行者。
caspase-8 和-10 的抑制剂对 HeLa细胞凋亡的抑制作用表明死亡受体途径有可能参与这一过程[4]在慢性 B淋巴细胞性白血病患者原代培养细胞中,HK 诱导的凋亡特征是 caspase-3,-8和-9 活化以及 PARP剪切[7]在 HK处理的 CH27细胞中还发现：caspase-3 蛋白水解性活化和 PARP剪切caspase-3 抑制剂 z-DEVD-fmk和 caspase家族抑制剂 z-VAD-fmk显著阻断 HK诱导的凋亡[6]以上这些结果证明：激活 caspase是 MG和 HK诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制之一在人多发性骨髓瘤(MM)细胞株和复发的难治性 MM患者的肿瘤细胞中[10],虽然 HK触发 caspase-3,-7,-8,-9的活化,但 caspase家族抑制剂 z-VAD-fmk并不能阻断 HK诱导的细胞凋亡HK 可诱导线粒体释放凋亡诱导因子(AIF,一种非caspase依赖性凋亡实施者)而且在 HK诱导凋亡的 SU-DHL4细胞株中,caspase-3和-8 水平很低,提示 HK除了 caspase途径外还有和非 caspase依赖性途径参与了 HK诱导细胞凋亡的过程。
哺乳动物细胞凋亡主要有两条途径――死亡受体(death receptor,DR)途径和线粒体途径死亡受体是肿瘤坏死因子受体超家族成员,其跨膜蛋白胞浆区内具有死亡结构域,当配体与死亡受体结合后,死亡结构域和适应蛋白结合,招募上游 caspase,使上游 caspase活化,从而进一步活化下游 caspase,而下游 caspase参与凋亡降解中的重要底物的剪切,引起细胞凋亡粒体途径中,各种促凋亡信号促使细胞色素 C自线粒体释放到胞浆,在 ATP的参与下,胞浆细胞色素 C结合并活化胞浆蛋白 Apaf-1,从而导致 caspase-9自身剪切和活化,活化后的上游caspase-9进一步活化下游 caspase(主要是 caspase-3),使细胞凋亡在 MG诱导凋亡中发现,MG 能降低线粒体跨膜电位,诱导细胞色素 C释放入胞浆[2]在人鳞状细胞肺癌 CH27细胞株中,MG 能导致胞液内细胞色素 C的积聚和 caspase-9、caspase-3 和 caspase-6的激活[1]用 z-VAD-fmk预处理可显著抑制 MG诱导的细胞凋亡,但并不阻止胞液内细胞色素 C的累积在 MG诱导 Hep-G2细胞凋亡[11]和 HK诱导 CH27细胞凋亡[6]过程中也发现,线粒体细胞色素 C参与了细胞凋亡过程。
Bcl-2家族是细胞凋亡中线粒体途径的调控者,主要包括两类成员：抗凋亡蛋白(Bcl-2 和 Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(Bax、Bid 和 Bak等)在多项研究中发现,MG 和 HK对这些蛋白水平有影响在诱导 HeLa细胞凋亡实验中,MG 作用 12 h后 Bcl-XL减少,Bax 的表达明显增加,Bax/Bcl-XL 表达比率升高[4]Bax 的启动子区具有 p53结合区MG 使 HeLa细胞磷酸化 p53和 p53蛋白表达增加在人鳞状细胞肺癌 CH27细胞株中[1],80 mmol/L MG显著增加 Bad和 Bcl-XS蛋白质的表达,减少 Bcl-XL的表达Bcl-2 高度表达能对抗 MG诱导的 CH27细胞凋亡在HK诱导 RKO细胞凋亡中[12],HK 能上调 mRNA的表达水平和 Bid蛋白水平,并下调Bcl-XL,而对 Bax和 Bcl-2无影响,p53 表达不变Lin SY等[11]对 MG诱导 Hep-G2细胞凋亡的研究发现：胞液内游离 Ca2+增加,用磷脂酶 c抑制剂 U73122或细胞内 Ca2+螯合物 BAPTA/AM预处理,可抑制 MG引起的细胞内 Ca2+增加和激活 caspase-8、caspase-9 的作用,因此,这些细胞的凋亡发生率被大大减少。
用 ZB4(阻止 Fas反应机制)预处理这些细胞,则 MG诱导3的 caspase-8活化也减少,凋亡发生率减少激动型 Fas抗体 CH-11对 MG诱导的HeLa细胞死亡有协同作用,MG 与 CH-11共同作用 HeLa细胞 24 h后细胞死亡率显著高于 MG或 CH-11单独处理组这些结果提示,细胞内 Ca2+和 Fas功能等细胞内信号参与了 MG诱导的细胞凋亡[4]MG诱导了中等程度和持久的 JNK活化和 ERK灭活,而并不影响蛋白质水平提示这些激酶也参与了凋亡过程的起始阶段[1]2 抑制肿瘤转移Ikeda K等[13]在实验性和自发性转移模型中研究了 MG在肿瘤转移中的抗转移作用及其机制通过实验性 L5178Y- ML25淋巴瘤肝脾转移模型和实验性及自发性 B16-BL6黑色素瘤肺转移模型研究了 MG的抗肿瘤转移作用腹腔注射 2或 10 mg/kg MG能显著抑制肝脾转移或肺转移在自发性 B16-BL6黑色素瘤肺转移模型中,在肿瘤接种前后多次腹腔注射 MG 10 mg/kg,能显著抑制肺转移和原发肿瘤的生长MG 还能显著抑制 B16-BL6细胞侵犯重建的基底膜,而并不影响细胞的生长。
这些体内实验的结果显示,MG 表现出强大的抗转移活性,其作用机制为抑制肿瘤细胞侵袭Nagase H等[14]的研究发现：MG 和 HK显著抑制人纤维肉瘤 HT-1080细胞对基底膜的侵袭,作用呈剂量依赖性；抑制 HT-1080细胞转移(浓度为 100 μmol/L)；不影响细胞生长及对基底膜的粘附紫杉醇和 MG与 HK的混合物对肿瘤侵袭和转移的抑制率分别为 39.7%和 43.5%HT-1080 细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP-9),在侵袭过程中降解细胞外基质MG 与 HK能抑制 MMP-9活性,可能与其抑制肿瘤侵袭有关3 抑制肿瘤血管形成阻碍血管生成是 MG抑制肿瘤增殖的作用机制之一在 C57BL/6小鼠的背部皮下或右后足趾移植 B16-BL6细胞,分别定时 ip给予各种剂量的 MG背部皮下移植肿瘤 8 d后以及足趾移植 21 d后切除肿瘤,分别检测肿瘤的大小及新生血管数结果发现,MG 对背部皮下移植及右后足趾移植均有抑制肿瘤增殖的作用,新生血管数也明显减少[15]MG 还能诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡[16]MG 5～20 mmol/L 浓度依赖性诱导 VSMC凋亡,该效应可被 caspase抑制剂 z-VAD-fmk 50 mmol/L所阻断。
MG 显著增强 caspase-3和 caspase-9活性,降低线粒体电位MG 浓度依赖性下调 Bcl-2水平,但并不影响 Bcl-2相关性 x蛋白(Bax)或Bcl-XL在动物模型中,球囊血管成形术诱导的新生内膜形成可被 MG显著抑制,同时 Bcl-2蛋白水平下降这些结果提示：MG 通过线粒体死亡途径诱导 VSMC凋亡该效应是由下调 Bcl-2蛋白水平介导的HK是一种无毒的血管形成抑制剂在体外,HK 抑制内皮细胞株 SVR增殖HK对原代培养的人内皮细胞的抑制作用强于对成纤维细胞的抑制,该抑制作用可被 TNF-α(肿瘤坏死因子)相关性凋亡诱导配体的抗体所拮抗在裸鼠体内,HK 对血管肉瘤高度有效[17]4 抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞分化4MG和 HK能抑制多种肿瘤细胞增殖：包括 HeLa细胞[4]、B16-BL6、THP-1、BAE 和 HT-1080细胞株[9],人鳞状细胞肺癌 CH27细胞株[1]和人淋巴样白血病细胞 Molt 4B[5]在培养的人 COLO-205和 Hep-G2肿瘤细胞株中[3],3～10 mmol/L MG能剂量依赖性抑制 DNA合成,减少细胞数,但非变形细胞如角质形成细胞、成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),MG 在这些浓度未发现细胞毒性。
MG 减少 DNA合成且阻遏细胞周期停留在 G0/G1期MG 诱导的细胞周期阻遏作用只发生在当周期蛋白-CDK 系统被抑制、p21 蛋白表达被放大时在 COLO-205细胞株皮下种植至裸鼠。