单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,*,第三章 临床细菌学检验技术,第一节 细菌的形态学检查,,一、不染色标本 二、染色标本,,第二节 细菌别离培养和鉴定,,一、培养基的种类和选择 二、 别离培养,,三、生化反响 四、鉴定,,第三节 细菌的非培养检测方法〔简介〕,,一、免疫学检测 二、分子生物学检测,,三、细菌毒素检测 四、动物实验,,本章学习目标,1、形态学检查〔镜检〕意义,,2、G染色法原理、方法、结果、意义和操作本卷须知,,3、培养基概念、成分、分类与用途,,4、细菌别离方法及其用途,,5、常用生化反响原理、培养基、结果判定、应用,,6、细菌的非培养检测方法及其意义〔适用于？〕,,,第一节 细菌形态学检查,,是用普通光镜、相位差显微镜、荧光显微镜、电镜，通过染色或不染色标本,观察细菌菌体的形态、大小、排列、特殊结构及染色反响等,是对细菌鉴定的一种手段意义？**P45,,——通过细菌形态学检查〔镜检〕可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，而且根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，为进一步作生化反响、血清学鉴定提供依据；对少数细菌还可根据形态特征作出初步鉴定，对临床〔早期诊断和治疗疾病〕提供初步信息作为参考。
简介： 显微镜,,,,种类 特点 用途,,普通光学显微镜 可见光直射, 千倍 染色细菌形态结构,,暗视野显微镜 散射光,暗视野聚光器 活菌螺旋体动力,,相差显微镜 相差板变光相与振幅 活菌形态内部结构,,荧光显微镜 高压汞灯紫外光紫蓝光 抗原抗体助诊断,,荧光素标记细菌病毒,,电子显微镜 电子流,强磁透镜 外表与 超微结构,,透射、扫描，数十万~一百万,光学显微镜,,普通光学显微镜的分辨率为0.25um一般细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察普通光学显微镜(light microscope),显微镜放大法,,透射电镜,扫描电镜,,电子显微镜与光学显微镜的根本区别,,光学显微镜 电子显微镜,,分辨本领 200nm / 100nm 接近0.1nm,,光源〔波长〕 可见光400~700nm 电子束0.01~0.9nm,,紫外光200nm,,透 镜 玻璃透镜 电磁透镜,,真 空 不要求 1.33×10-5~1.33 ×10-3Pa,,成像原理 利用样品对光的吸收 利用样品对电子的散射,,形成明暗反差和颜色变化 和透射形成明暗反差,,一．不染色标本检查法,,观察活菌的形态及运动情况；,,常用压滴法或悬滴法、毛细管法〔厌氧菌〕,,二．染色标本检查法,,〔一〕常用染料 碱性、酸性、复合染料,,〔二〕常用染色方法,,1.单染色法:观察细菌的形态、大小、排列及某些特殊成分。
2.复染色法(鉴别染色法):观察细菌的大小、形态、排列、特殊结构及染色性细菌的形态检查法,,,,不染色标本检查法:,观察细菌的大小、形态、动力,(主要),,压滴法,,悬滴法,,染色标本检查法:,毛细管法,,,单染色法——,观察细菌的形态、大小 、排列,,,,革兰氏染色法,,复染色法,(鉴别染色法),,抗酸染色法,,,观察细菌的大小、形态、排列、,,特殊结构染色法,,特殊结构及染色性,荧光染色法,细菌的检查方法,,常用复染色法,A.革兰染色法:,,细菌常规染色法；染色结果紫〔蓝〕色为G+ 菌，红色为G—菌B.抗酸染色法:,,常用于结核分枝杆菌等抗酸菌的检查；抗酸菌染成红色其他蓝色C.特殊染色法:,,细菌结构如荚膜、芽胞、鞭毛以及细胞壁、异染颗粒等的染色革兰染色法：,,,结晶紫 碘液 95%乙醇 复红,,抗酸染色：,,,石炭酸复红 3%盐酸酒精 碱性美兰,,其它特殊染色,染色法,1min,1min,1min,脱色,5min,脱色,革兰阳性,,革兰阴性,抗酸染色阳性,1min,,革兰氏染色法,,[原理]等电点学说、化学学说、细胞壁结构学说,,〔1〕细胞壁成分和结构的不同：G+菌肽聚糖多、 G-菌肽聚糖少，但脂类含量高,,〔2〕等电点的不同: G+菌pI 2~3、G-菌pI 4~5,,〔3〕G+含核糖核酸镁盐,,[根本程序],,1. 制片: 涂片〔枯燥〕 → 固定,,2. 染色: 1min 1min 半min 1min,,结晶紫染液-- 卢戈氏碘液-- 95％酒精-- 稀释石炭酸复红染液--吸干后镜检,,(初染) 水洗 (媒染) 水洗 (脱色)水洗 (复染) 水洗,,,,革〔格〕兰染色法,,[影响因素]:,,1. 培养基成分; 2. 培养条件; 3. 操作技术。
操作技术方面指: 涂片厚薄、枯燥固定、脱色时间(此为关键步骤),,,[临床意义] 鉴别细菌、选择药物参考、与致病性有关,,[革兰染色本卷须知],,1、涂片取菌〔标本〕过程严格无菌操作；涂片厚薄均匀，一般涂呈云雾状薄片，拇指大小；,,2、自然枯燥为好，假设烘干要缓慢，玻片不烫手为度；玻片标本必须经固定，一般火焰快速往返3次；,,3、玻片稍放凉方能加染料染色；染料加量适宜，要覆盖整个涂片区域并不外流；,,4、染色步骤的顺序不能调乱，时间严格把握，但脱色时间可依涂片厚薄适当调整；,,5、冲水时连同染料随流水冲去，不宜先将染料倒去再冲；〔这样可能有未溶的染料残渣积留在玻片〕,,6、染色完毕要待玻片完全枯燥才能滴油镜检课堂检测,,1、使用普通光学显微镜，采用悬滴法可观察细菌的〔 〕,,A 鞭毛 B 芽孢 C 菌毛 D 动力 E 荚膜,,2、格兰染色液中稀释复红的作用是〔 〕,,A 固定 B 初染 C 媒染 D 脱色 E 复染,,3、不属于细菌形态学检查范畴的是〔 〕,,A 暗视野显微镜观察细菌动力,,B 光镜观察细菌的排列方式,,C 鞭毛染色观察细菌染色性,,D 格兰染色观察细菌染色性,,E 观察菌落在血板上的溶血性,,4、.以下属于酸性染料的是〔 〕,,A 美兰 B 天青 C 硫堇 D 伊红 E 苏木素,,5、标本采集一般原那么表达错误的选项是〔 〕,,A 标本采集时间最好是病程早期、急性期或病症典型时,,B 标本可在使用抗菌药物之前或用药后采集,,C 采集的标本应无外源性污染,,D 采集无菌标本时，应严格进行无菌操作,,E 对于正常菌群寄生部位采集的标本，要采用特殊选择性培养基,,6.革兰氏染色结果判定G+应为〔 〕,,A 红色 B 紫色 C 兰色 D 黄色 E 白色,,7、革兰染色所用试剂的顺序是〔 〕,,A 稀释复红→ 碘液→ 酒精→ 结晶紫,,B 结晶紫→ 酒精→ 碘液→ 稀释复红,,C 结晶紫→ 碘液→ 酒精→ 稀释复红,,D 稀释复红→ 酒精→ 结晶紫→ 碘液,,E 稀释复红→ 结晶紫→ 碘液→ 酒精,,8.细菌形态学检验〔直接及染色镜检〕的意义错误的选项是〔 〕,,A 迅速了解标本中有无细菌及大致菌量,,B 根据细菌形态、结构和染色性对病原菌作确诊,,C 镜检可初步识别病原菌，为选择培养基和进一步作生化反响、血清学鉴定提供依据,,D 镜检对临床早期诊断和治疗疾病有参考意义,,E 某些标本中的特定细菌通过形态学检查可得到初步诊断,,第二节 细菌别离培养和鉴定,,,一、培养基的种类和选择,,培养基(culture medium) ：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。
P35,,用途：？**P35,,,〔 一〕培养基的主要成分及其作用,,1、营养物质——肉浸液或牛肉膏、蛋白胨、无机盐类、血〔清〕鸡蛋、糖醇类、生长因子等,,2、水分；,,3、凝固物质〔琼脂〕；,,4、抑制剂和指示剂；,,,〔二〕培养基的分类,按其营养组成和用途分类：,,根底培养基、,,营养培养基,,鉴别培养基,,选择培养基,,特殊培养基〔厌氧、L型细菌培养等〕,,按其物理状态分类：固体培养基,,液体培养基,,半固体培养基,,按其成分分类：合成培养基、天然培养基,,,,〔三〕培养基的选择,,临床标本常规别离用培养基,,〔四〕培养基的制备,,一般程序：,,调配,,溶化,,矫正PH,,过滤澄清,,分装 / 灭菌,,鉴定,,保存,,,本卷须知？,,概念,,微生物的培养——是指根据微生物的生理特征，用适宜的营养基质和培养条件培养微生物的过程接种——是指将微生物的纯菌种或含有微生物的材料〔水、土、血脓粪尿等标本〕转移到培养基上的过程菌落——由单个细菌在固体培养基上生长繁殖形成的单一的、肉眼可见的细菌集团，称为菌落〔划线别离法，接种的细菌能适当分开，1个菌落为1个活菌繁殖而成，菌落为纯种〕,二、别离培养,,增菌培养——病原菌含量少的标本接种于选择性的液体培养基中大量繁殖，以提高标本中含量较少的目的菌的检出率，称为增菌培养。
别离培养——对于混有多种细菌的临床标本或其它培养物，经过划线接种到固体培养基外表，因划线的分散作用，使许多原先混杂的细菌细胞在固体培养基外表散开，一般经过18~24h培养后可得到单个菌落，供细菌计数及纯培养用，称为别离培养纯培养——挑选单个菌落转种至另一培养基中，生长出来的细菌均为纯种，称为纯培养〔一〕细菌的别离接种方法**P36,,1、平板划线别离法：,,分区划线法 别离含菌量多标本,,连续划线法 别离含菌量少标本,,2、琼脂斜面接种法 纯种增菌、保存菌种,,3、液体培养基接种法 增菌生长与生化反响,,4、穿刺接种法 动力试验、高层琼脂,,5、倾注平板法 定量培养、细菌计数,,6、涂布接种法 药敏试验、生物制品菌苗生产,,判断平板分段划线法接种结果优劣的标准有哪些?**,,〔1〕严格遵循无菌操作并无污染菌；,,〔2〕分区明显，能充分利用培养基面积；,,〔3〕力度角度适宜，不划破琼脂；,,〔4〕线条密而不重叠〔1区可除外〕，连接适合，不多交、少交、漏交及错交；,,〔5〕到达别离目的，获得尽可能多的单个独立菌落〔二〕细菌的培养方法,,,1、需氧培养法——针对需氧或兼性厌氧菌的有氧培养；,,空气中，37℃孵育箱18~24h〔因菌种而异〕；,,箱中可放置一杯水以保持湿度；时间长者管口封石蜡-凡士林以防干裂；,,2、二氧化碳培养,,CO2箱培养、 烛缸培养、 化学法〔重碳酸盐-盐酸法〕,,,3、微需氧培养——5%~6%O2+5%~10%CO2+85%N2,,,4、厌氧培养〔物理法、化学法、生物法〕,,厌氧罐,,〔三〕细菌的生长现象,,1、固体培养基：菌落？CFU？,,菌落描述：大小形状扁凸凹边缘颜色 外表透明度黏度等,,种类：光滑型S、粗糙型R、黏液型M,,有鉴定意义的菌落特征：溶血、色素、气味,,2、液体培养基 ：,,均匀混浊：大多数细菌,,沉淀：链球菌、炭疽杆菌,,菌膜〔外表生长〕：需氧菌—枯、TB、绿,,3、半固体培养基〔穿刺接种〕,,沿穿刺线生长，周围澄清透明〔动力-〕,,羽毛状或云雾状或毛刷状生长〔动力+〕,,细菌在固体培养基中的生长情况,光滑型菌落,粗糙型菌落,粘液型菌落,,细菌在液体培养基中的生长情况,菌膜,菌沉淀,均匀浑浊,对照,,细菌在半固体培养基中的生长情况,1、3：有动力,,2：无动力,,三、生化反响,〔一〕碳水化合物的代谢试验,,1、糖醇类发酵 2、氧化-发酵实验〔O/F试验〕,,3、β-半乳糖苷酶试验〔ONPG〕4、七叶苷水解试验,,5、甲基红试验(M) 6、VP试验(V),,〔二〕蛋白质和氨基酸的代谢试验,,1、明胶液化试验 2、吲哚试验(I) 3、硫化氢试验(S),,4、尿素酶试验(U) 5、氨基酸脱氨基\羧基试验,,〔三〕碳源和氮源利用试验,,1、枸橼酸盐利用试验(C) 2、丙二酸盐利用试验,,糖发酵试验,,阳性,吲哚试验,大肠杆菌：+,,产气杆菌：—,,,甲基红试验,阳性,阴性,对照,,大肠杆菌：+,,产气杆菌：—,,,VP,试,,验,阴性,阳性,大肠杆菌：—,,产气杆菌：+,,,枸橼酸利用试验,大肠杆菌：—,,产气杆菌：+,,,H,2,S,试验,,尿素酶试验,对照,阳性,阴性,,〔四〕各种酶类试验,,,1、氧化酶试验 2、触酶〔过氧化氢〕试验,,3、硝酸盐复原试验 4、脂酶试验,,5、卵磷脂酶试验 6、DNA酶试验,,7、凝固酶试验 8、CAMP试验,,9、胆汁溶菌试验,,〔五〕抑菌试验,,1、O/129抑菌试验 2、杆菌肽试验,,3、optochin试验,,,细菌〔经典〕的生化反响,,工程 培养基 原色 阳性结果 阴性结果 观察时处理,,糖醇类发酵 发酵管 紫/红 变色+气泡 + 不变 — 直接观察,,变色无气 + 颜色依指示剂而定,,甲基红MR 葡磷水 淡黄 变橘红 橘黄色 + MR指示剂轻摇,,伏普VP 葡磷水 淡黄 红色 不变 + VP试剂并水浴混匀,,吲哚/靛基质 胨水 淡黄 红色 不变 缓缓+I试剂于液面,,硫化氢 醋酸铅 灰白 黑色 不变 穿刺线or菌落中心,,尿素酶 尿素 无色 变红 不变 直接观察,,枸橼酸盐利用 西蒙氏 绿色 变深蓝 绿色 直接观察,,硝酸盐复原 硝酸盐 无色 红色 无色 +硝酸盐试剂A(或再+B),,苯丙氨酸脱氨酶 苯丙氨酸 无色 绿色 不变 缓缓+FeCl3,,脱羧基 赖AA\鸟AA 黄绿 紫 同AA对色 直接,,葡O/F 、 KIA 、MIU ……,,第四节 细菌的非培养检测方法〔简介〕,一、免疫学检测,,〔一〕抗原检测 〔二〕抗体检测,,二、分子生物学检测,,〔一〕核酸杂交 〔二〕聚合酶链反响,,〔三〕生物芯片技术,,三、细菌毒素检测,,〔一〕内毒素 〔二〕外毒素,,四、动物实验,,常见细菌性疾病动物接种的鉴别诊断,P,45应用？,,课堂检测,,1、培养基固形剂是〔 〕,,A 蛋白胨 B 牛肉膏 C 氯化钠 D 琼脂 E 水,,,A 根底培养基 B 鉴别培养基 C 营养培养基,,D 选择培养基 E 厌氧培养基,,2、双糖铁培养基属于〔 〕,,3、葡萄糖H-L〔O/F试验〕培养基属于〔 〕,,4、能抑制某些细菌生长而有利于另一些细菌生长的培养基〔 〕,,,5、靛基质试验阳性是因为该菌能分解〔 〕,,A 葡萄糖 B 色氨酸 C 胱氨酸,,D 对二甲基氨基苯甲醛 E 靛基质,,6．细菌在液体培养基的生长现象有,,A 出现沉淀 B 形成菌膜 C 形成菌苔,,D 形成菌落 E 液体浑浊,,,A 斜面接种法 B 分区划线法 C 连续划线法,,D 穿刺接种法 E 倾注培养法,,7.接种杂菌量较多的标本适用〔 〕,,8.单个菌落纯培养及保存菌种等适用〔 〕,,9.测定牛乳、饮水、尿液等细菌计数适用〔 〕,,A 葡O/F试验 B 枸橼酸盐利用试验 C 吲哚试验,,D 氧化酶试验 E 硝酸盐复原试验,,10、硝酸盐复原试验属于〔 〕,,11.属于碳源利用试验的是,,12.参加对二甲基氨基苯甲醛观察结果的是,,13.试验结果使对苯二胺显色的是,,,A 单糖发酵管 B 蛋白腖水,,C 葡萄糖蛋白腖水 D 尿素培养基,,E 醋酸铅培养基,,14．靛基质试验选用的培养基,,15．伏普试验选用的培养基,,16．甲基红试验选用的培养基,,17．硫化氢生成试验选用的培养基,,18. 试管塞塞入试管的长度应为试管塞全长的〔 〕,,A 2/3 B 1/3 C 3/4 D 1/4 E 1/2,,19.吸管上端塞入棉花制作无菌吸管〔 〕,,A 是为了防止菌液吸入口 B 过滤有菌空气,,C 棉花要塞紧并且致密,,D 干烤灭菌可以超过160℃ E 以上均不对,,20.关于低温保存细菌，以下表达哪些正确〔 〕多,,A 低温保存细菌时，温度必须迅速降低，否那么可促使细菌死亡,,B 冷冻时参加甘油、血清、牛奶等保护剂，可使细菌增多,,C 反复屡次冻融细菌不会造成大局部细菌死亡,,D 在低温状态下真空抽干，去尽水分，可防止解冻时对细菌的损伤,,E 目前保存菌种最好的方法是冷冻真空枯燥法,,21. 试验台被污染时，用消毒剂覆盖污染区域的消毒时间不少于〔 〕,,A 1min B 3min C 5min D 10min E 20min,,22.以下表达错误的选项是〔 〕〔多〕,,A 糖发酵试验阳性培养基显碱性,,B 脲酶试验阳性培养基显碱性，呈红色,,C 枸橼酸盐利用试验阳性时显碱性，呈红色，有细菌生长,,D KIA培养基中出现黑色为硫化氢试验阳性,,E MIU培养基全变红说明动力试验阳性,,23.以下哪些生化反响需添加试剂后观察结果〔 〕多,,A 糖发酵试验 B 靛基质试验,,C 甲基红试验 D 枸橼酸盐利用试验,,E V-P试验,,1、简述革兰氏染色法原理、操作步骤、结果和本卷须知。
2、细菌形态学检验有何意义？,,3、解释：菌落、菌苔、别离培养、纯培养、增菌培养、培养基,,4、培养基的主要用途有哪些？,,5．配制好的培养基为什么要鉴定？如何鉴定？,,6．非培养检测方法有哪几种？有何优点？,,7．判断平板分段划线法接种结果优劣的标准有哪些?,,8．列出常用的接种方法及其用途9．细菌在培养基中有哪些生长现象？,,10、常见生化反响原理、方法、结果？,,11．某同学进行细菌接种操作，次日观察，平板上有线外生长的细菌，请你分析原因？,C3,思考题,,。