附件2新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）药品审评中心2020年8月38目 录一、前言 1二、模板设计、转录模板质粒构建和菌种库研究资料 3（一）目标抗原选择和DNA模板设计 3（二）转录模板质粒的构建和制备 4（三）种子库的建立和检定 4三、生产工艺 5（一）一般要求 5（二）mRNA原液生产 6（三）制剂处方及生产工艺 10四、质量特性研究 14（一）mRNA的结构分析和理化性质分析 15（二）纳米颗粒的结构分析和理化性质分析 15（三）杂质分析 16（四）生物学活性研究 18五、质量标准 19（一）DNA转录模板 19（二）mRNA原液 20（三）制剂中间产物 20（四）成品 21（五）方法学研究和方法学验证 22（六）标准品 23六、稳定性研究 23七、直接接触制品的包装材料和容器的来源、选择依据及质量标准等研究 24八、应急状态下药学研发的阶段性考虑与研发期间的变更 24（一）种子库 25（二）生产工艺 25（三）质量特性研究 26（四）质量标准 26（五）临床申报阶段应提供能够支持临床试验开展的稳定性研究数据 27（六）研发期间的工艺变更 27九、名词解释 28十、参考文献 28一、前言mRNA疫苗是将外源目的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞并表达目的蛋白、刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。
mRNA疫苗具有以下特点：（1）能导入细胞，在体内表达相应的抗原蛋白，避免了体外蛋白表达、纯化过程；（2）能够刺激免疫系统产生体液免疫和/或细胞免疫应答，发挥相应的免疫预防和/或免疫治疗作用；（3）其递送系统具有类似佐剂的部分特性，能够通过刺激机体免疫系统产生多种细胞因子等方式增强机体免疫反应能力或改变免疫应答类型；（4）由于mRNA的降解是通过细胞正常代谢完成，降低了因感染或整合诱发基因突变的潜在风险尽管mRNA疫苗在巨细胞病毒(CMV)、流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等多种传染病临床研究中取得了一定的研究进展，但尚存在待确证的诸多问题，如，mRNA本身具有的潜在免疫原性；递送系统（如，脂质纳米颗粒）的稳定性、纳米剂型安全性及所使用阳离子聚合物/脂质体安全性、递送靶向性及递送效力等诸多问题，影响疫苗的有效性、安全性和质量可控性mRNA疫苗通常需采用较为复杂的制剂系统，其药学研发和生产控制涉及诸多特殊考虑，包括：（1）mRNA序列的分子设计对mRNA稳定性、目的抗原的表达效率、免疫原性均可能产生影响，如加帽结构的选择、非翻译区序列的选择及序列的改构、目的序列的优化、核苷酸的化学修饰等方面；（2）制剂组成、结构和工艺具有特殊性，主要特点是涉及阳离子聚合物或脂质材料、递送系统的结构多样性及纳米级粒径特性、工艺复杂性等，需要通过研究确认主要的考察指标来进行制剂处方组成和工艺的优化以及控制策略的建立；（3）同时可能涉及新免疫调节组分表达及新辅料的使用，必要时，需要单独的安全性研究支持。
本指导原则是根据新型冠状病毒肺炎疫情防控应急工作需要，基于对此类疫苗有限的科学认知水平起草，用于指导应急状态下mRNA疫苗研制，明确现阶段对mRNA疫苗研发技术的基本要求，相关内容将随着新型冠状病毒及mRNA疫苗研究进展和认知的不断深入予以更新本指导原则并不代表对新型冠状病毒疫苗类型的推荐性意见本指导原则主要针对非自我扩增型mRNA疫苗，对于自我扩增型mRNA疫苗、多组分mRNA疫苗在借鉴本指导原则时还需根据产品相关特点和属性开展相应研究针对突发公共卫生紧急情况新药研发中药学研究的阶段性、渐进性等特点，研发者需要提前统筹新药整体研发设计考虑，应提交药学研发路线图、阶段性研究方案及各阶段风险控制的策略在各阶段，若有简化或减免的有关研究，应阐释说明依据和理由，提交资料前建议进行充分的沟通交流二、模板设计、转录模板质粒构建和菌种库研究资料（一）目标抗原选择和DNA模板设计1.目的抗原选择依据及来源明确目的抗原来源、氨基酸和基因序列及蛋白结构，并与我国当前流行株的核苷酸和氨基酸同源性进行分析；明确目的抗原选择的依据以及其表达蛋白在预防新型冠状病毒中的作用或作用机理针对新型冠状病毒，建议结合产品完成的临床前毒理研究同时考虑不同序列选择对疫苗抗体依赖性感染增强（ADE）效应、肺部免疫病理反应等的潜在影响。
应提供目的产物的理论序列、分子量、分子式、二硫键（如有）、修饰（如有）等重要结构信息2.DNA转录模板序列设计及结构（1）对DNA转录模板设计进行全面阐述，除目的抗原涉及的mRNA序列外，需重点提供其功能性元件的设计及确认研究结果，如，帽子结构设计，转录启动子的选择，5’UTR和3’UTR的设计，信号肽的设计，Poly(A)加尾结构/长度设计、所用核苷三磷酸（NTP）类型及其修饰信息等2）若对编码目标抗原的mRNA序列进行了任何修饰、序列改构或序列优化（如密码子优化等），均应详细提供修饰或序列更改的依据与目的（如提高mRNA翻译效率、降低先天免疫原性、增加稳定性等）应提供结构示意图等，并对基因修饰或序列改构的利弊进行权衡分析，提供确认的支持性研究结果如可能，应评估构建的mRNA疫苗本身的免疫原性某些情况下，若构建的基因序列包括除抗原目的基因以外的其它基因序列时，应对额外引入基因序列的作用和选择依据进行分析，如具有利于S蛋白三聚体形成的额外插入序列等，并提供相应序列设计及确认研究数据结果二）转录模板质粒的构建和制备（1）应对转录模板的控制元件和选择标记的序列与来源进行阐述，如：转录启动子、转录终止序列、抗生素抗性标记等进行分析。
抗生素使用应符合《中国药典》的相关要求2）应提供构建和制备转录模板质粒的详细信息和步骤、鉴定及确证方法3）对转录模板质粒应结合工程菌种子库的检定进行全基因序列分析及确认，提供用于生产mRNA的转录模板的全长核苷酸序列，尤其对转录模板的控制元件、插入的目的基因序列、选择标记基因有无变异等进行分析三）种子库的建立和检定如DNA转录模板制备涉及质粒构建及工程菌的使用，还应按《中华人民共和国药典》相关规定或与国际通行要求建立种子库系统，并提供国家药品检定机构相应检定报告1）明确宿主菌的来源、基因型、表型以及目标克隆筛选的流程鼓励对宿主菌开展鉴定研究，鉴定项目可包括：鉴别、抗生素敏感性等2）工程菌的建立及鉴定：经转化条件优化后，将合格的目标质粒转化至适宜的工程菌，经克隆筛选后建立种子库系统3）种子库的检定：应保证种子库无外源因子污染及目的基因序列和其他元件的准确性，包括细菌形态学、培养物纯度、质粒限制酶切图谱、目的基因和其他元件测序等鼓励对工程菌活性、质粒保有率、鉴别、抗生素抗性等指标进行检定4）传代稳定性研究：开展种子库遗传稳定性分析（序列大小、序列准确性、质粒限制酶切图谱、质粒拷贝数）并明确各级种子库的限定传代代次及依据。
说明各级种子库的制备规模、保存条件、扩增条件、允许的传代次数等信息三、生产工艺（一）一般要求工艺开发阶段，应进行各步工艺参数对mRNA和/或制剂质量特性影响的研究研发阶段应通过工艺参数的研究和优化，确立mRNA和/或制剂的生产工艺及工艺过程控制策略临床样品制备工艺应具备一定规模，并且还应具有一定的生产连续性和放大可行性，临床样品应在符合GMP的条件下生产生产的连续性和可控性可结合开发阶段、平台先期先验工艺经验、工艺成熟度、过程检测充分性等多方面综合评价产品开发进程中应不断积累数据，持续确认工艺的一致性和可控程度上市生产开始前应明确关键工艺参数，在此基础上建立充分的生产工艺过程控制策略，包括关键及主要工艺操作参数控制、中间产品性能参数检测以及相应的检测方法等研究数据应能够支持对工艺稳定性及批间一致性的分析评价二）mRNA原液生产1.原液生产用主要原材料 生产用原材料应符合现行版《中华人民共和国药典》相关规定和/或与国际通行要求一致提供工程菌以外的生产用其它原材料的来源、质量标准及检定报告应重点提供以下原材料的相关信息：用于转录的核苷酸和修饰核苷酸、5’-帽类似物、用于mRNA体外合成大量使用的各种酶（如T7转录酶、加帽反应过程中添加的酶等）和缓冲液、原液生产过程中使用的反应及纯化介质（层析柱、磁珠、过滤膜）溶剂等。
对于采用重组技术或生物/化学合成技术自行制备的生产用原材料（如T7转录酶、焦磷酸酶、RNA酶抑制剂等），需提供相应的生产工艺和质量研究资料对于生产中使用的各种酶的保真度需予以分析对于5’-帽类似物、核苷酸等原材料的质量标准应含有可充分表征产品相关杂质的纯度检测，如，质谱、核磁、HPLC等方法原液和制剂生产过程中原则上应避免人或动物来源的成分如果使用人源或动物源物质，应符合《中华人民共和国药典》相关规定和/或参照ICH Q5A等技术指南提供外源因子风险评估2.工艺研究及确认mRNA原液生产工艺一般分为两个阶段，即DNA转录模板的制备和mRNA的制备转录模板制备可采用质粒DNA扩增或PCR扩增、纯化及线性化等方法；mRNA制备工艺通常采用转录模板进行mRNA体外转录、mRNA加帽、去磷酸化、DNA酶处理、mRNA纯化等步骤获得mRNA原液mRNA修饰（如修饰核苷的加入）、加Poly(A)尾通常在转录过程中进行；加帽可在转录过程中同时进行也可作为单独的工艺步骤应明确生产工艺流程，提交流程图，说明相应工艺步骤的目的、工艺流程步骤、过程控制描述、物料流转及中间产物等应提供原液生产工艺各步骤的研究内容，对生产工艺各步骤中各种工艺参数进行探索和优化，建立稳定工艺，并制定相应的过程控制策略。
需提供工艺确认资料，包括工艺过程控制确认（含中间产物关键质量属性是否符合可接受标准及关键工艺参数、重要工艺参数是否在控制范围内等）、批次放行数据结果及必要的杂质清除效果等数据2.1 转录模板的制备如采用转录模板质粒扩增/线性化工艺，需考虑研究优化的工艺参数如：质粒浓度、质粒线性化酶浓度、孵育时间、温度等如采用PCR扩增工艺，需考虑研究优化的工艺参数如温度、PCR扩增体系、循环次数、时间、温度等需对转录模板制备的关键工艺参数及其控制范围进行确认，并建立相应的过程控制检测标准，如线性化效率、模板浓度、序列准确性、纯度、杂质残留等如需储存，应明确储存条件、储存方式并进行相关支持性研究2.2 mRNA合成应对mRNA的体外转录、加Poly(A)尾、加帽、去磷酸化、DNA酶处理等工艺步骤的关键工艺参数进行研究与优化，对关键工艺参数及其控制范围进行确认，如：1）体外转录工艺中的反应体系、RNA聚合酶浓度、NTP浓度、转录时间、温度、终止反应条件等；2）DNA酶处理工艺（如有）中的DNA酶浓度、处理时间、温度、终止反应条件等；3）加帽步骤应研究RNA反应浓度、温度、时间，加帽反应缓冲体系、物料投料比（如5’-帽类似物、鸟苷三磷酸、核糖核酸酶抑制剂、相关转移酶等）、补料方式、反应温度、时间等，工艺过程中需关注加帽的效率、mRNA片段的降解情况以及序列的准确性，对加帽类型及不同加帽类型的比例进行研究；4）去磷酸化工艺中（如有）的磷酸酶浓度、反应时间等；5）如涉及修饰核苷酸，应明确被修饰的核苷酸、修饰类型、修饰后的纯化方法和纯度、投料比例等。
应对上述工艺步骤产物进行过程控制检测，如加帽率、加Poly(A)尾产物长度、mRNA序列完整性、序列准确性、纯度、mRNA浓度、副反应产物浓度（不完整mRNA、双链RNA、截短RNA、长链RNA等）、残留蛋白、。