实验室技术操作规范、无菌操作要求食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌 条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品， 二是保证工作人员 安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染1 .接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽2 .进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室 缓冲问，工作前经紫外线消毒后使用3 .接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用 75%酒精棉球将手擦干净4 .进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使 用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用 95%酉精点燃烧灼三次后使用5 .从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试 管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边6 .接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从 包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒7 .接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环 和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸 5min,再经火焰烧灼8 .吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
二、无菌间使用要求1 .无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设 有与无菌间大小相应的缓冲问及推拉门， 另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无 菌向后传递物品2 .无菌间内应保持清洁，工作后用 2%-3哪酚皂溶液消毒，擦拭工作台面， 不得存放与实验无关的物品3 .无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒 时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min,使用紫外灯，应 注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响4 .处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递 物品，可通过小窗传递5 .在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等， 必须经灭菌后方能使用1 .灭菌前准备(1)所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装 严密，如用金属筒应将上面通气孔打开2)装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出， 用纱布包好2 .装放(1)干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
2)大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品 之间不能过挤3 .设备检查(1)检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整2)压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观 察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞3)对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否 符合于进行灭菌处理的要求4 .灭菌处理手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：a. 手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L (重复使用时 应将水量补足，水变混浊需更换)b.手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中 (无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用)c. 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源， 并打开顶盖上的排气阀放了冷气(水沸腾后排气 10-15min)d.关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间(按灭菌物品性 质与有关情况而定)e. 达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢 复到零时，自然冷却至 60c后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而 应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到 60c以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。
5.灭菌温度与时间灭菌温度121 C灭菌时间 培养基等(易蒸发、营养物质易分解 )物质一般灭菌20~30min器皿类物品一般灭菌时间不低于1h6.灭菌后的检查灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度 污染.(1) 物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌 物品使用.(2) 取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用.(3) 培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃.(4) 启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭.(5) 取出的物品掉落在地或误放不洁这处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用.(6) 取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放.(7) 凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限.(8) 每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者四、有毒有菌污物处理要求微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室1. 经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内， 并隼中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌2. 经微生物污染的培养物，必须经 121c30 min高压灭菌。
3. 染菌后的吸管，使用后放入 5 %煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡 24h （消毒液体不得低于浸泡的高度）再经 121c30 min高压灭菌4. 涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲 在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入 5%煤酚皂溶液中浸 泡24 h后，煮沸洗涤做凝隼试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤5. 打碎的培养物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位， 浸泡半小时后再擦拭干净 污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤五、培养基制备要求培养基制备的质量将直接影响微生物生长因为各种微生物对其营养要求不 完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：1. 根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸储水中，在使用前对应用的 试剂药品应进行质量检验2. PH 测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况 下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一 次培养基PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察但 需注意因高压灭菌可影响一些培养基的 PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或 次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完 PH后再加入。
3. 培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用 脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条 要预先洗净凉干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度4. 盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好5. 培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价 值，一般121c 15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚硫酸钾、卵黄、TTG抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至 50c左右再加入6. 每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验如果是生 化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基 不应贮存过久，必要时可置4c冰箱存放7. 目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观 察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用， 新购进的或存放过久的干 燥培养基，在配制时也应测PH,使用时需根据产品说明书用量和方法进行8,每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人 员等应做好记录，以备查询。
六、样品采集及处理要求1. 所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加 工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染 源存在2. 根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行3. 采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得 使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物 或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方 可应用4. 样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过 3h,如路程较远，可保存在1〜5c环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检5. 检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验 （1） 样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者2） 瓶、 袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品 形状者（食物中毒样品除外）3） 按规定采样数量不足者 对送检符合要 求的样品，检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置 4c冰箱存 放，及时准备创造条件，然后进行检验。
6. 样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理1）液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种2）固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共 25g,置于225ml灭菌生理盐水 或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种3)瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种七、样品检验、记录和报告的要求1 . 检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行 检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染2 .样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录， 以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改 和伪造。