题 目 发酵生产琥珀酸的研究进展姓 名 吴志洪所在学院 化学与化工学院 专 业 生物工程 学 号 0908110342 日 期 2012年12月10日 发酵生产琥珀酸的研究进展摘要近年来，因瘤胃微生物产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes具有高的琥珀酸产量，并能够利用多种碳源进行发酵等优点，在利用发酵法生产琥珀酸领域具有广泛的应用前景和商业化价值，因而其代谢途径和发酵工艺等基础研究成为国内外研发的热点近年来，人们在产琥珀酸放线杆菌的代谢途径、琥珀酸发酵动力学模型、新型经济培养基以及高产菌株选育等方面的研究取得了很大进展，对研发琥珀酸发酵工艺、降低生产成本和节能减耗等具有重要的理论意义关键词；琥珀酸、发酵、产琥珀酸放1琥珀酸的简介1.1 琥珀酸，学名丁二酸它是一种重要的有机合成中间体，主要应用于食品、医药、生物降解甥料、表面活性剂、洗涤剂、绿色溶剂和动植物生长刺激物等领域[1]目前，通过发酵法生产得到的琥珀酸，其价格大约为0．55一1．10$／kg[2]图1-1丁二酸的分子结构1.2 它是厌氧代谢的发酵产物之一琥珀酸广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品、塑料等行业，也可以作为 C4 平台化合物，合成一些重要的化工产品如丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、n-甲基吡咯烷酮(NMD)、2-吡咯烷酮等，全世界市场需求量超过276000 t/a. 1.3 利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖,木糖等）生产琥珀酸, 由于原料来源广泛且价格低廉, 污染小, 环境友好, 且在发酵过程中可吸收固定CO2, 能有效缓解温室效应, 开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径, 近年来成为研究的热点[3-4]。
2 生物发酵法制备丁二酸2.1发酵菌种丁二酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物一般情况下，丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌能够分泌丁二酸据报道，一些乳酸菌(LactobaciIlus)也能在特定的培养基上不同程度地产生丁二酸国外在20世纪90年代就开始发酵生产丁二酸的研究， 目前报道的发酵产丁二酸的菌种主要Anaerobiospirillum succiniciproducens[4]、Actinobacillus succinogenes[5] 、Mannheimia succiniciproducens[6]和另外还有如Corynebacterium glutamicum、Mannheimia succiniciproducens[7]等菌种由于天然菌株的产丁二酸能力非常低，发酵产物多种多样，对糖或丁二酸的耐受性比较差，因此必须运用生物工程技术对现有的菌种进行 [8]2. 2重组大肠杆菌产发酵丁二酸野生大肠杆菌产丁二酸的代谢途径：一般认为, 野生型E. coli 在有氧环境中, 琥珀酸仅作为TCA 循环中的中间产物, 没有积累; 但在厌氧环境下, 进行混合酸发酵（图1）, 并认为存在六条途径可以代谢生成琥珀酸（图2）。
其中, 琥珀酸主要的产生途径为葡萄糖经过糖酵解途经生成磷酸烯醇式丙酮酸, 并进而代谢合成草酰乙酸、苹果酸、富马酸, 最终以琥珀酸的形式积累在此合成途径中, 每1 mol 葡萄糖生成2 mol NADH, 生成1 mol 琥珀酸需要消耗 2 mol 的NADH, 而生成乳酸、甲酸和乙酸则只需消耗1mol 的NADH 甚至不需要消耗NADH, 因此, 在野生大肠杆菌中, 琥珀酸由于需要更多的还原力, 积累很少 图1 大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径[9]Fig. 1 Pathways of anaerobic mixed acid fermentation for Escherichia coli图2 大肠杆菌K-12 发酵产丁二酸途径Fig. 2 Pathways for the formation of the fermentation product succinate in Escherichia coli K-12[13] Note: 1: PEP carboxykinase; 2: Malate dehydrogenase; 3: Fumarase;4: Fumarate reductase; 5: PEP carboxylase; 6: Aspartate: glutamate transaminase; 7: Aspartase; 8: Succinic semialdehyde dehydrogenase; 9: γ-aminobutyrate: glutamate transaminase; 10: Glutamate decarboxylase;11: Isocitrate lyase[10]3 产琥珀酸大肠杆菌基因改造策略：3.1 增强琥珀酸代谢途径中关键酶：a 超量表达内源性基因：苹果酸酶催化苹果酸与丙酮酸之间的反应,正常生理条件下该酶催化动力学上有利的苹果酸转化为丙酮酸的正向反应, 但苹果酸酶在特定的菌种中有可能催化从丙酮酸到苹果酸的逆向反应, 原因是该反应方向在热力学上是有利的。
大肠杆菌中编码苹果酸酶的基因sfcA, 在E. coli双突变株NZN111 中超量表达后, 由于该菌株缺乏乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂解酶活性, 导致丙酮酸的大量积累, 使苹果酸酶逆向催化生成苹果酸,并以琥珀酸作为最终还原产物而大量积累PEP 羧化酶基因(ppc)和PEP 羧化激酶基因(pck)催化PEP 与草酰乙酸(OAA)之间的反应Millard等人发现PEP 羧化酶可能是大肠杆菌厌氧混合酸发酵中催化PEP 至OAA 最主要的酶, 而当ppc 缺陷时, PEP 羧化激酶可催化该反应富马酸还原酶是厌氧琥珀酸合成途径中另外一个关键酶, 其核苷酸序列、氨基酸序列与琥珀酸脱氢酶相似, 均可催化富马酸与琥珀酸之间的反应,仅与底物之间的亲和力有所差异3.2 b引入外源性基因：在大肠杆菌中过量表达内源性基因取得了很好的效果, 且由于稀有密码子少等原因容易表达, 但发展空间较小, 目前很多研究者尝试在E. coli中引入外源基因, 尤其是大肠杆菌自身不含的酶基因来构建新的代谢途径(如pyc 基因)以提高琥珀酸收率及生产强度3.3 敲除或失活琥珀酸竞争途径中的酶：野生型大肠杆菌厌氧混合酸发酵过程中主要产物为乳酸, 甲酸和乙酸, 若要获得高浓度的琥珀酸积累, 则必需减少这些副产物的生成, 使更多的代谢流流向琥珀酸[11]。
4 重复批次发酵简介重复批次发酵，即在发酵结束后回收发酵液中的细胞，转入新鲜培养基，继续发酵，进行重复批次生产重复批次发酵可以延长了菌体的发酵时间，提高了产物的总产量，达到了细胞重复利用的效果重复批次发酵在乙醇生产过程中应用较多大肠杆菌发酵丁二酸后期，由于产物抑制作用，产物增加不再明显，但是细胞仍具有较高发酵能力因此，回收细胞，进行重复批次发酵具有重要意义根据丁二酸发酵液的主要特点，回收发酵液中菌体，进行了重复批次发酵每批次发酵采用细胞转化的方法，即将回收的细胞悬浮无菌水中，仅补加葡萄糖和碳酸镁，然后进行厌氧发酵，并考察了细胞浓度、初始葡萄糖浓度、pH调节剂对细胞转化的影响相比于两阶段发酵，细胞转化节约了氮源和细胞生长期的能量消耗重复批次转化循环利用菌体，延长丁二酸发酵时间，提高丁二酸总产量，有利于丁二酸的工业化生产.5 化学合成培养基及优化为了达到某种日的，需要设计专门的培养基来满足实验要求AM3培养基就是为了研究产琥珀酸大肠杆菌的代谢途径而设计的培养基，McKinlay等[12]比较了AM3培养基与富集培养基中该菌的生长和产物形成情况，并研究了NaHCO，对产物的形成、菌体生长及代谢效率的影响。
结果表明，低浓度的NaHCO，对其影响较大，而高浓度基本没有影响，当浓度在25mmol／L时，菌体生长速率最大 国内在培养基设计方面也做丁不少努力，郑璞等[13]利通过响应面分析法对ActinobaciUus succinogenesCGMCC 1593所用发酵培养基进行了优化，并分析了碳源和氮源物质对琥珀酸产生的影响，并H该菌在优化后的培养基中琥珀酸的产量达到了41．699／L另外，玉米皮[14]啤酒废酵母酶解液|15]也被用来作为发酵培养基的成分，琥珀酸产量与合成培养基相当6 高产菌株的筛选高产菌株的选育主要是通过诱变和驯化的方法对原菌株进行操作，并对选育出的高产菌株做稳定性实验验证，最终确定高产菌株的筛选结果诱变法具有不定向性，可能通过阻断或改变琥珀酸及副产物的代谢途径，从而得到高产且副产物较少的荫株一项研究表明[16]，经过NTG诱变并利用氟乙酸作为选择压力筛选出的SF-9菌株琥珀产量叮以达到35．09/L，比出发菌株增加21．4％，同样乙酸的产量有所下降7 展望产琥珀酸大肠杆菌作为一株很具发展前景的产琥珀酸菌株，以其独特的优势成为国内外的研发对象口前，产琥珀酸大肠杆菌发酵生产琥珀酸存在产物抑制和基因改造工具缺乏两个难题，阻碍r琥珀酸产量的进一步提高。
在今后的工作中，可以从以下几个方面着手进行解决1)发展发酵与分离耦合工艺，及时将产物转移出来，从而消除或减弱产物抑制2)通过诱变和驯化的方法筛选高耐受性菌株3)深入研究产琥珀酸大肠杆菌的代谢途径及关键酶的表达调控机制4)构建表达载体，利用代谢途径构建工程菌，提高琥珀酸产量总之，随着研究的不断深入，发酵法将成为工业化生产琥珀酸的主要方法，并且有望取代化学合成方法参考文献[1]詹晓jb，朱一晖，Wang|)0ng}．ai．琥珀酸发酵生产工艺及其产品f仃场．食I协科技，2003(2)：“-49[2]McKinlay J B，Vieille C，Zeikus J G．Prospects for a bio-basedsuccinate industry．Appl Mierobiol Bioteehnol，2007(76)：727[3]詹晓北, 朱一晖, Donghai Wang．琥珀酸发酵生产工艺及其产品市场. 食品科技, 2003, 2: 44−49. [4] 王大勋, 马铁宁. 从深度氧化石蜡中提取琥珀酸. 化学工程师, 2003, 96(3): 15−16.[5]朱蕾蕾，刘宇鹏，郑璞，等．一株丁二酸产生菌的筛选及鉴定[J]．微生物通报，2007 34(1)：80—83 . [6]Lee P C，Lee S Y，Hong S H ，et a1．Isolation and characterization of a new succinic acid—producingbacterium ，Mannheimia SUciniciproducens MBEL55E，from bovine rumen[J]．App1．Microbio1 Biotechno1．2002，58：663—666． [7]张玉秀，王 姣，王 丹，齐 峰. 大肠杆菌产琥珀酸基因工程研究进展. 中国生物工程杂志, 29(7): 108~117.[8]谢鑫，陈可泉，刘忠敏，姜岷，韦萍.产丁二酸大肠杆菌的构建及其厌氧发酵.生物工程学报，24（1）：101-105.[9]Clark DP. The fermentation pathways of Escherichia coli.FEMS Microbiology Reviews, 1989, 63(3): 223−234.[10] Van der Werf MJ, Guettler MV, Jain MK, et al. Env。