秸秆中纤维素/半纤维素和木质素的几种 测定方法对比 秸秆中纤维素/半纤维素和木质素的几种 测定方法对比 陈贤情 商晋 宋慧芳 郭康权 （西北农林科技大学机械与电子工程学院，陕西杨凌西农路 22 号，712100） 摘 要：摘 要：农作物秸秆的基本物理化学特性是的其综合利用重要依据秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素 和木质素，其测定方法各有利弊本文对比了几种不同测试方法和测试手段，从耗时、操作难易程度和数 据可靠性等方面对纤维素、半纤维素和木质素的测定方法进行综合比较，给出了各测试方法的优缺点，并 对几种改进方法作了介绍其中，Van Soest 方法比较简单实用，一般实验室都能进行，但结果准确性低 并且过滤困难；王玉万法可以同时进行多个试样的分析，但测定纤维素含量偏高，半纤维素含量偏低；高 效液相色谱法数据可靠，重复性好，但仪器贵，测试成本较高 关键词关键词：秸秆，纤维素，半纤维素，木质素 0 引 言 0 引 言 中国秸秆资源丰富， 但是大部分被当作肥料直接还田或者被当作燃料烧掉， 随着科技的 发展，一些较深层次的秸秆加工技术应运而生，如秸秆生物质气化技术、颗粒炭化技术、秸 秆纤维的生物转化等。
农作物秸秆的基本物理化学特性是的其综合利用重要依据， 秸秆的基 本组织是纤维素、半纤维素和木质素，其含量的多少为其综合利用提供重要依据纤维素、 半纤维素和木质素的测定方法有多种Van Soest 于 1967 年提出纤维素、半纤维素、木质 素的测定程序，得到研究学者的普遍应用； 1987 年王玉万等提出了木质纤维素固体基质发 酵物中半纤维素、纤维素和木质素的定量测定分析程序；Van Soest 于 1991 年对其方法进 行了改进；李华针对 Van Soest 法进行了进一步改进，取得了良好的效果；国际可再生能源 实验室发布了高效液相色谱法测定纤维素、半纤维素、木质素，测定结果比较可靠本文对 纤维素、半纤维素、木质素的几种测定方法进行了对比分析，旨在为测定秸秆中的纤维素、 半纤维素、木质素提供方法参考，为不同检测目的的学者提供选择依据 1 方法原理 1 方法原理 1.1 Van Soest法 Van Soest 法在国内又称范式法，它是将样品经中性洗涤剂煮沸处理，不溶解的残渣为 中性洗涤纤维，主要为细胞壁成分，其中包括半纤维素、纤维素、酸不溶木质素和硅酸盐 样品经酸性洗涤剂处理，剩余的残渣为酸性洗涤纤维，其中包括纤维素、酸不溶木质素和硅 酸盐，中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维的差值即为半纤维素含量。
酸性洗涤纤维经 72%硫酸处 理后的残渣为酸不溶木质素和硅酸盐， 从酸性洗涤纤维值中减去 72%硫酸处理后的残渣为样 品的纤维素含量将 72%硫酸处理后的残渣先干燥，再灰化，在灰化过程中逸出的部分为酸 性洗涤木质素的含量 1.1.1 王玉万法 王玉万的系统分析程序是将中性洗涤剂法与 2M 盐酸水解法、 地衣酚比色法、 72%硫酸法、 蒽酮法和差重法综合应用具体是：用中性洗涤剂将样品中的杂质（蛋白质、脂肪、淀粉、 糖等）去除，用 2M H2SO4法将半纤维素水解，然后用地衣酚比色法测定木糖的含量，转换为 半纤维素的含量，再用 72%H2SO4水解法将纤维素水解，用蒽酮比色法测定还原糖的量，再转 化为样品中纤维素的含量，最后用差重法，及将剩余的残渣（包括酸不溶木质素和硅酸盐） 先干燥称重，再灰化，称重，用前后重量之差得出酸不溶木质素的含量 1.3 高效液相色谱法 高效液相色谱法是结合 72% H2SO4水解法、差重法与高效液相色谱仪的综合应用先将 样品用 72% H2SO4水解，不容残渣（主要包括酸不溶木质素和硅酸盐）用差重法测定酸不溶 木质素的含量， 滤液经过一系列中和及过滤处理， 进入高压液相色谱系统， 结合标准曲线法， 测定各种单糖的含量，进而转化为样品中纤维素、半纤维素的含量。
2 试验内容和方法 2 试验内容和方法 试验于 2011 年在陕西杨凌进行，选取了小麦秸秆、棉花秆、玉米秸秆的叶子、髓心、 皮为试验素材，对每个样品分别用 Van Soest 法、王玉万法、高效液相色谱法测定，每种方 法重复测定 4 次，测定结果取平均值 2.1 Van Soest法 2.1.1 中性洗涤纤维测定 准确称取 1.000g 样品（通过 40 目筛）置于直筒烧杯中，加入 100ml 中性洗涤剂和数滴 十氢化萘及 0.5g 无水亚硫酸钠将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在 5~10min 内煮沸，并持 续保持微沸 60min煮沸完毕后，取下直筒烧杯，将烧杯中溶液倒入安装在抽滤瓶上已知重 量的玻璃坩埚中进行过滤，将烧杯中的残渣全部移入，并用沸水冲洗玻璃坩埚与残渣，直到 洗至滤液呈中性为止 用 20ml 丙酮冲洗二次， 抽滤 将玻璃坩埚置于 105℃烘箱中烘 2h 后， 在干燥器中冷却 30 min 称重，直称至恒重 2.1.2 酸性洗涤纤维测定 准确称取 1.000g 样品（通过 40 目筛）置于直筒烧杯中，加入 100 ml 酸性洗涤剂和数 滴十氢化萘及 0.5g 无水亚硫酸钠。
将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在 5~10min 内煮沸，并 持续保持微沸 60min趁热用已知重量的玻璃坩埚抽滤，并用沸水反复冲洗玻璃坩埚及残渣 至滤液呈中性为止用少量丙酮冲洗残渣至抽下的丙酮液呈无色为止，并抽净丙酮将玻璃 坩埚置于 105℃烘箱中烘 2h 后，在干燥器中冷却 30 min 称重，直称至恒重 2.1.3 酸性洗涤木质素和酸不溶灰分（AIA）测定 将酸性洗涤纤维加入 5ml 72%硫酸中，在 20℃消化 3h 后过滤，并冲洗至中性消化过 程中溶解部分为纤维素， 不溶解的残渣为酸性洗涤木质素和酸不溶灰分， 将残渣烘干并灼烧 灰化后称重，即可得出酸性洗涤木质素和酸不溶灰分的含量 2.1.4 结果计算 中性洗涤纤维含量的计算：NDF（%）=（W1－W2）/ W×100 式中： W1—玻璃坩埚和 NDF 重（g） ；W2—玻璃坩埚重（g） ；W—试样重（g） 酸性洗涤纤维含量的计算：ADF（%）=（G1－G2）/G×100 式中： G1—玻璃坩埚和 ADF 重（g） ；G2—玻璃坩埚重（g） ；W—试样重（g） 半纤维素含量的计算：半纤维素（%）=NDF（%）－ADF（%） 纤维素含量的计算：纤维素=ADF（%）－经 72%硫酸处理后的残渣（%） 酸性洗涤木质素（ADL）含量的计算：ADL（%）=经 72%硫酸处理后的残渣（%）－灰化 后的灰分（硅酸盐,%） 2.2 王玉万法 王玉万的纤维素、半纤维素、木质素定量分析程序见图 1。
2.3高效液相色谱法 2.3.1 将坩埚置于马弗炉中 575℃烘 4h，之后与干燥器中冷却，恒重，记下重量，再将坩埚 置于马弗炉中 575℃烘干 1h，干燥器中冷却，恒重，再记下重量，前后两次重量之差小于 0.3mg 2.3.2 称取 0.300g±10mg 样品与试管中，同时做上重复，进行标记，每支试管中加入 3.00 ±0.1ml 72%的 H2SO4，搅拌 1min，在 30℃水中水浴 60±5min，每隔 5~10min 搅拌一次，使 其充分水解 2.3.3 用已经称量至恒重的坩埚将水解液真空过滤，将滤液备用（用来测定半纤维素、纤维 素） 2.3.4 用去离子水将滤渣定量转移到过滤坩埚中，用 50ml 热去离子水洗涤残渣，将坩埚和 残渣置于 105℃烘 4h，直至恒重，再将其转移到干燥器中，记录重量，再将坩埚和残渣置于 马弗炉中 575±25℃烘 24±6h，完了在干燥器中冷却，再次称重，前后两次重量的差值就是 酸不溶木质素的含量 2.3.5 取滤液 20ml 于 50ml 烧杯中，用 CaCO3中和至 pH5~6,最多不能超过 6，然后将样品过 0.2 微米滤膜，再注入高压液相色谱的自动进样器， 2.3.6 高压液相色谱柱分析条件： 图 1 半纤维素、纤维素、木质素的定量分析程序 1.样品 0.5000g 置于 100ml 碘量瓶中，加入 50ml 中性洗涤剂，之后放入已沸的 高压蒸汽消毒器中，100℃保温 1h，取出用 3 号砂芯漏斗过滤，残渣用水丙酮洗 残渣 滤液 2.置于 100ml 碘量瓶中，加入 50ml2M 盐酸溶液，然后放入已沸的高压 消毒器中，100℃准确保温 50min，之后用 3 号砂芯漏斗过滤，水洗残渣至 pH6.5-7.0 滤液 残渣 3.适当稀释，取 1ml 加 4ml 地衣酚试剂，100℃保温 20min， 于 660nm 测定 OD，由木糖标准曲 线求出糖量，乘上系数 0.9 4.用丙酮洗 2 次，60℃干燥，然后置于 50ml 烧杯中，加入 5ml72%的 H2SO4，20℃水解 3h，然 后加入蒸馏水 45ml，室温过夜，次日用已经称恒 重的 3 号砂芯漏斗过滤，水洗残渣至 pH6.5 半纤 滤液 残渣 5.适当稀释，取 1ml 加 4ml 蒽酮试剂，100℃保温 10min，于 620nm 测定 OD，由葡萄糖标准曲 线求出糖量，乘上系数 0.9 6.于 80℃烘干， 称重之后，550℃灰 化，得灰分 纤维木质 进样量：10~50μl 流动相：色谱级的去离子水，过 0.2μm 滤膜，脱气 流速：0.6mL/min 柱温：80~85℃ 检测器温度：接近柱温 检测器：示差折光检测器 运行时间：35min 2.4数据分析方法 数据以X±S 表示,采用统计软件 SPSS 13.0 进行显著性分析。
3 结果与分析 3 结果与分析 3.1 耗时 表 1 3 种测定方法耗时比较 样品 煮沸时间 烘干 水解时间过滤时间灰化 总计 Van Soest 法 2 5 3 4 24 38（h） 王玉万法 2.5 6 11 2 24 45.5（h） 高效液相色谱法 — 9 1 1 24 35（h） Van Soest 法第一步由于果胶质、蛋白质、淀粉的去除不完全，过滤比较困难，耗时较 多；王玉万法由于加了 72%的硫酸水解之后，要稀释，再过夜水解，耗时最多，达到 45.5h； 高效液相色谱法在烘坩埚的时候耗掉的时间比较多，达 9h，此时耗能也较多三种方法灰 化测定木质素的时间是一样多的，都是 24 小时 3.2操作难易程度 表 2 三种方法对仪器的特殊要求 样品 特殊要求 Van Soest 法 — 王玉万法 — 高效液相色谱法 配有示差折光检测器的高压液相色谱仪 Van Soest 法和王玉万法操作比较简单，一般实验室都能进行，这也是广大学者应用比 较多的方法； 高效液相色谱法测定中需要配有示差折光检测器的高压液相色谱仪， 不论高压 液相色谱仪器， 还是示差折光检测器价格都比较昂贵， 此方法只被一部分研究所和高校采用。
3.3数据可靠性 表 3 纤维素测定结果 纤维素含量/(%) 样品 Van Soest 法 王玉万法 高效液相色谱法 小麦秸秆 18.24±0.92 19.34±0.28 18.72±0.04 棉花杆 13.61±0.57 17.08±0.85 15.11±0.02 玉米皮 13.57±0.84 15.28±0.64 14.51±0.09 玉米叶子 17.76±1.38 20.47±1.37 19.61±0.03 玉米髓心 13.88±0.85 15.27±1.37 14.49±0.19 由表 3 分析可得：高效液相色谱法误差限比较小，方法准确；Van Soest 法、王玉万法 误差限较大， 准确度不如高效液相色谱方法， 其中王玉万法在用 2M H2SO4将半纤维水解时候， 水解的不完全，导致一部分半纤维素进入纤维素的测定程序，用 72%的 H2SO4水解纤维素时 候， 残余的半纤维素也水解掉，导致纤维素含量偏高，半纤维素含量偏低（可见表 5） 表 4 纤维素测定方法结果显著性比较 Van Soest 法 王玉万法高效液相色谱法 Van Soest 法 王玉万法 0.009 高效液相色谱法 0.015 0.015 。