肿瘤】CAR-T免疫疗法肿瘤治疗的临床及基础研究成果阅读人群：肿瘤领域/神经胶质瘤文献档次：Clin Cancer Res. 2015 （8分） 英文题目：Bioactivity and Safety of IL13Ra2-Redirected Chimeric Antigen Receptor CD8+T Cells in Patients with Recurrent Glioblastoma中文题目：IL13Ra2靶向的CAR CD8+ T细胞 对复发性神经胶质瘤治疗的仃效性和安全性评 价第1部分思路精要这是一篇延续性的文章，作者所在团队此前己经评价了 IL13Ra2靶向的CAR CD8+ T细胞在体外和动物体内的抗肿瘤疗效，本文献在已有研究的基础上，继续推进该成果的首次临床试验(first-in-human)o第2部分背景介绍临床现象神经胶质瘤(glioblastoma)作为目前致死率很高的癌症类型之一，其5年 生存率低于10%0科学问题CART作为目前很有前景的治疗策略，或许可以应用到神经胶质瘤的治 疗上CD19+CART细胞临床治疗B-ALL成功的案列说明其治疗癌症 的可行性，但是对于将CART应用到实体瘤治疗中还有许多需要研究的 问题和克服的难题。
分子机制研究切入点本文献作者所在团队此前一直关注针对神经胶质瘤IL13Ra2靶点的T 细胞免疫治疗，IL13RQ2在50%以上的神经胶质瘤患者中高表达，且 其高表达与预后差具有相关性在前期研究中，作者已成功构建IL13Ra2特异性、MHC非依赖性CAR,命名为IL13-zetakineo IL13-zetakine+细胞毒性T淋巴细胞在体外与靶 细胞接触后可分泌T"细胞因了；在体内可清除小鼠神经胶质瘤荷瘤模 型基于上述结果，作者拟开展针对神经胶质瘤靶向IL13Ra2的首次 人体试验(first-in-human)研究对象靶向IL13Ra2的CART细胞疗法治疗神经胶质瘤复发的3位临床患者第3部分研究内容一、病人的选择标准本试验选择患者（年龄18・70岁）神经胶质瘤需是单病灶、恶性程度为 III或IV级，病情未累及脑室和脑脊液，适合手术治疗且预期生存期大 于三个月、类固醇非依赖、己完成前期治疗（$2周）、急性副反应恢 复止常患者的选择不考虑抗原IL13Ra2表达水平准入患者在加入该项试验初期，收集其外周血单核细胞分离CD8+细 胞毒性T淋巴细胞，构建表达IL-13zetakine CAR和HyTK选择/自杀 融合蛋白的CART细胞，构建成功后冷冻保存待后期使用。
待患者首次 复发时，手术切除瘤组织，并在手术部位安装Rickham reservoir/catheter装置，于此同时复苏此前冻存的IL-13 zetakine CART 细胞，在体外大量扩增手术恢复并MR成像后，将IL-13 zetakine CART 通过留置的导管直接注射入手术部位本临床设计采用的治疗策略可对患者本身进行剂量爬坡试验，以周为循 环，共经历5周、12次的CART注射（图1A） o在第仁2、4、5周 的第仁3、5天每次注射一次CART,第3周为休息期为安全起见, 在第一个循环的第仁3、5天，分别注射细胞剂量为10\ 5x107、此后再以10*剂量注射其余9次在第三周休息期和第5周后成像，监 测CART治疗的疗效Rackographicevidence ofprogression/recurrence;Excision;Ervolment; 1Leukapheresis —<► Generation and cryopreservation of IL13zete* HyTK* CD8* CTL clone productPlacement o
对于CART细胞的构建，首先通过OKT3刺激外周血单核细胞，将IL-13 zetakine CAR通过电转导入细胞内，然后用hygromucin筛选，通过有 限稀释法挑选CD8+CAR T细胞克隆，最后将阳性克隆在体外大量扩增 至所需数量(图1B) oDay 0:Leukapherests;PBMC isolationand OKT3activationDay 3:ElectroporateDay 6:InitiatehygrcxnycinselectionRjw cytometryUpon thaw and》 expansion to appropriate cel no., tested viabikty and stenlity/Myco/Endotoxin prior to re-mfusionSouthern; Western, flow cytometry; CRA;viability; GCV sensitivity;IL2 dependence: slenlity/Myco/Endotoxin三、3位患者自体IL-13 zetakine+细胞毒性T淋巴细胞克隆的鉴定对三位患者自体IL-13 zetakine+细胞毒性T淋巴细胞克隆鉴定的结果如 图1C所示。
通过Southern blot分析其单位点整合、通过流式细胞仪考 察其IL-13 zetakine CAR表达水平流式结果也表明，CAR-T克隆也表 达T细胞受体a卩、CD3、CD8,呈现效应T细胞激活状态（CD45RO+、 CD69+、CD95十），但不表达中心记忆细胞标志物（CD45RA・、CD62L-、 CCR7-、CD 127・）所有的CART克隆均表达NKG2D共刺激受体和CD28, T细胞衰老标志物Tim-3也有一定程度的表达，但不表达KLRG-1和 PD-1等其他衰老相关蛋白构建的CART细胞在体外可特异性溶解IL-13Ra2阳性的U251T胶质瘤 细胞和过表达IL-13Ra2的Daudi细胞，但对IL-13Ra2阴性的Daudi亲 本细胞无杀伤作用有趣的是，靶细胞溶解能力的强弱与T细胞表面 CAR的表达量无关（比较低表达克隆UPN033 3C12与高表达克隆UPN031 4Cll)oSouthernUPN 028 Clone 5F6FIoa/CytometryEEflEIL13 TCR CD3 CD851Cr-Release2S:1 fcl 1:1Effector targetUPN 031Clone 4C11CD28 CD69 NKG2O TIM-32S:1 S:1 1:1Effector:targetUPN 033Clone 3C12IL13 TCR 83 CD8□BBECD28 CD69 NKG2D TIM-3CD95CD951007550250Daudi-Ro2U251TDaudi25:1 &1 1:1Effectortarget四、治疗概况该项研究的主要目的是考察神经胶质瘤患者术后采用自体IL-13Ra2特 异性CAR CD8+ T细胞治疗的可行性和安全性。
13位参与者中共有10 位患者重构的CART细胞符合标准，另三位患者(UPN024. UPN029.UPN032)在CART细胞完全构建成功前病情恶化UPN025、UPN027、 UPN030三位患者分别由于多病灶、死亡和类固醇依赖的原因无法接受 CART治疗；UPN026、UPN034、UPN038三位患者在本试验结束时未 出现复发症状；UPN036患者自愿退出仅余下的三位患者UPN028、 UPN031、UPN033 接受了 最终的 CART 细胞治疗对 UPN028、UPN031、UPN033三位患者的手术癌组织IL13Ra2进行免疫组织化学和qPCR检 测，结果显示UPN028的IL13Ra2表达最低、UPN033中等、UPN031 最高（图2A-2C）o此前作者研究发现来自UPN033患者的干细胞样和 分化的神经胶质瘤细胞均可被其自体的IL-13 zetakine+细胞毒性T淋巴 细胞杀死，说明细胞本身的分化状态不影响IL13Ra2抗原的表达和靶向(％0v)8Z0N6A(％0D ・60% tumor, red cutiinel C gene expression of IL13Ra2 mRNA leveis evatuated by qPCR usng Taqman gene expression assay.五、IL-13 zetakine+ CAR T细胞注射的安全性图lA拟定的患者自身剂量爬坡计划仅在UPN03KUPN033两位患者中 全部完成，另一位患者UPN028由于暂时性头疼第3个循环第1天的108 剂量组未注射。
心和5x107剂量组未出现CART细胞相关的三级以上 副反应，然而在 W剂量时，患者UPN028出现2次三级以上头疼患 者UPN031出现三级神经毒性反应（曳行步态和舌体歪斜），在经过10 mg地塞米松静脉注射后，4天后症状好转，该患者严重的副反应可能 与靶点IL13Ra2表达水平高相关，也可能与其出现的第三次复发（CAR T细胞治疗后第12周）相关综上，IL13R（x2特异性CAR CD8+ T细 胞治疗（12次注射，累计细胞数目为10.6x10s）对于神经胶质瘤术后患 者来说是可行的，仅出现暂时性副反应MRI和FLAIR成像结果显示，三位患者均由于过继性T细胞转移在注 射部位出现脑炎症脑炎症的出现在细胞注射的前2个循环即出现，且 随着时间的推迟UPN028和UPN033两位患者（无复发）在几个月内逐 渐好转，这说明炎症是由于治疗细胞导致的,而非病情恶化（图3A-3B） 高表达IL13Ra2的患者UPN031,其炎症反应的程度也更加严重，且与 其他2位患者相比，U。