分子标记辅助选择分子标记辅助选择Molecular Marker-Assisted Selection MAS刘龙博、李洁、张杰刘龙博、李洁、张杰 目目 录录一、简介二、应用实例 一、简介： 分子标记辅助选择(Molecular Marker-Assisted Selection MAS)是利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记进行间接选择,是对目标性状在DNA水平的选择,不受环境影响,不受等位基因显隐性关系干扰,选择结果可靠,同时又可避免等位基因间显隐性关系的干扰,从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良;标记辅助育种具有标记基因型鉴定可以在低世代和植株生长的任何阶段进行、共显性的分子标记允许在杂合体阶段进行鉴定隐性基因、对目的基因的选择不受基因表达和环境条件的影响等优点 分子标记辅助育种它是将分子标记应用于作物改良的一种手段其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离的分子标记对选择个体进行目标以及全基因组筛选,从而减少连锁累赘,获得期望的个体,达到提高育种效率的目的 分子标记辅助选择是分子标记技术用于作物改良的重要领域,是传统育种技术和现代生物技术相结合的产物。
分子标记（DNA标记）：能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异分子标记的类型：分子标记的类型：①基于DNA-DNA杂交的分子标记，如RFLP（Restriction fragment length polymorphism,即限制性长度片段多态性）②基于 PCR的分子标记，RAPD （Random amplified polymorphic DNA，即随机引物扩增多态性DNA技术） ③限制性酶切和PCR结合的分子标记， AFLP（Amplified fragment length polymorphism，即扩增片段长度多态性分析技术）④基于 DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（Single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性） 分子标记辅助选择的优越性：分子标记辅助选择的优越性：①可以在植物发育的任何阶段进行选择,对目标性状的选择不受基因表达和环境的影响,可在早代进行准确的选择,加速育种进程,提高育种效率;②共显性标记可区分纯合体和杂合体,不需下代再鉴定,而且在分离世代能快速准确地鉴定植株的基因型。
③可有效地对抗病性、抗逆性和根部性状等表型鉴定困难的性状进行基因型鉴定在育种项目的初期,育种材料较少,不允许做重复鉴定,或要冒一定风险利用分子标记技术则可克服基因型鉴定的困难④可聚合多个有利基因提高育种效率⑤克服不良性状连锁,有利于导入远缘优良基因 影响分子标记辅助选择的主要因素：影响分子标记辅助选择的主要因素： ①① 标记与连锁基因间的连锁程度标记与连锁基因间的连锁程度回交选择程序中的分子标记辅助选择技术可分为前景选择( foreground selection)和背景选择(back-ground selection)前景选择是在对回交群体的选择中,通过对转入受体中的与供体优良基因座位紧密连锁的标记或基因内标记的检测,从而筛选出携带目标基因的单株前景选择的准确性主要取决于标记与目标基因的连锁强度,标记与基因连锁得愈紧密,依据标记进行选择的可靠性就愈高 ②②性状的遗传率性状的遗传率性状的遗传率极大地影响MAS选择效率遗传率较高的性状,根据表型就可对其实施选择,此时分子标记提供的信息量较少,MAS效率随性状遗传率增加而显著降低在群体大小有限的情况下,低遗传率的性状,进行MAS的相对效率较高,但存在一个最适的群体大小,在此限之下MAS效率会降低。
③③群体大小群体大小群体大小是制约MAS选择效率的重要因素之一一般情况下,MAS群体大小不应小于200个选择效率随着群体增加而提高,特别是在低世代,遗传率较低的情况下尤为明显④④选用分子标记数目选用分子标记数目理论上标记数越多,从中筛选出对目标性状有显著效应标记机会就越大,因而应有利于MAS事实上,MAS效率随标记数增加先增后减MAS效率主要取决于对目标性状有显著效应的标记,因而选择时所用标记数并非越多越好⑤⑤世代的影响世代的影响对基因组中除了目的基因之外的其它部分的选择,即背景选择背景选择目标之一是减少目标等位基因载体染色体上供体基因组的比例;目标之二是减少非目标等位基因载体染色体上的供体基因组背景选择尽可能覆盖整个基因组,进行全基因组的选择在早代变异方差大,重组个体多,中选几率大因此背景选择应在育种早期世代进行,随着世代的增加,背景选择效率会逐渐下降 ⑥⑥控制性状基因数目控制性状基因数目模拟研究发现,随着QTL（数量性状基因座，它指的是控制数量性状的基因在基因组中的位置）增加,MAS效率降低当目标性状由少数几个基因(1~3)控制时,用标记选择对发掘遗传潜力较为有效;然而当目标性状由多个基因控制时,由于需要选择世代较多,加剧了标记与QTL位点间的重组,降低了标记选择效果;在少数QTL可解释大部分变异的情况下,MAS效率较高。
二、应用实例：《利用SNP和EST-SSR分子标记鉴定荔枝新种质御金球》，孙清明， 李永忠， 向旭，等，2013年11卷第3期，第403-414页，分子植物育种（Molecular Plant Breeding） 此项研究利用自主开发的荔枝SNP和EST-SSR两种分子标记技术，对近年发掘的荔枝优稀种质御金球进行分子鉴定，明确其与现有的363份荔枝种质的亲缘关系，以探索其是否为新种质，并揭示亲本来源，为进行新品种保护提供分子证据 SNP分型技术首次成功地用于荔枝新种质御金球的亲本来源鉴定，为今后荔枝种质的鉴别提供了可借鉴手段1、、实验材料与方法实验材料与方法1.1实验材料实验材料此研究共用364份1.2 EST-SSR检测检测引物来源：引物序列来自孙清明等(2011)，从中挑选13对多态性高，扩增稳定的EST-SSR引物用于种质分析PCR反应：使用Biometra PCR仪进行PCR扩增；94℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，28个循环；72 ℃5 min 采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压150 V,时间2 h)进行PCR产物分离，电泳缓冲液(1 TBE)，参照McCouch等(1997)的方法进行银染显色。
数据分析：利用NTSYS 2.10e软件进行相似性数据分析，采用SM系数计算种质之间的相似性系数，进行UPGMA聚类 1.3 SNP检测检测引物设计：将前期获得的两个荔枝品种的转录组数据进行比对，从中发掘SNP位点，利用Primer Premier 5.0软件设计引物PCR反应：利用Biometra PCR仪进行PCR扩增PCR扩增程序：变性(95 ℃ 3 min)；50个扩增循环(95 ℃ 15 s, (55 ±1 ℃) 10 s, 72 ℃ 8 s)；变性 、复性(94 ℃ 30 s,28 ℃ 30 s）HRM（高分辨率熔解曲线技术(high resolution melting, HRM)由于具有高通量快速准确分析简单等优点已被广泛用于人类致病基因突变的SNP分型诊断中）检测及数据分析：利用Light Cycler (Spectron)进行HRM检测；利用MEGA5中的Align进行序列比对，UPGMA进行种质间系统演化分析,并计算演化分化系数2、结果与分析、结果与分析2.1御金球与现有御金球与现有363 份荔枝种质的亲缘关系份荔枝种质的亲缘关系 13对EST-SSR引物在供试的364份种质中共产生122条谱带，其中多态性条带112条，多态性比例为91.8% 。
御金球与其他种质的遗传相似性系数介于0.1230~0.8770之间，可见，御金球不同于其他363份荔枝种质 从50对SNP引物中筛选出17对（见表）扩增效率高分型效果明显的SNP引物利用这些引物对御金球与现有363份荔枝种质进行亲缘关系分析 结果表明，17对SNP引物均表现为二等位性，御金球与其它363份荔枝种质的演化分化系数介于0.043~1.924之间，可见SNP分型同样证明御金球是一份新种质 2.2御金球御金球22份疑似亲本种质的亲缘关系分析份疑似亲本种质的亲缘关系分析 选择22份御金球的疑似亲本种质，对其进行EST-SSR和SNP分子标记鉴定分析 EST-SSR分析表明，御金球与22疑似亲本的相似系数为0.4590~0.8443 从图3可以看出，御金球与糯米糍的亲缘关系最近(相似系数为0.8443)，随后与红灯笼聚到一起，并最终与怀枝类(同沙迟怀枝, 焦核怀枝和怀枝)聚到一起；而与广东广西和云南来源的胭脂红并未首先聚到一起可见，御金球不同于胭脂红，而是与糯米糍及怀枝类型的种质更相似一些 SNP分析与EST-SSR的鉴定结果相似御金球与22份疑似亲本种质的演化分化系数介于0.088~1.804之间。
其中，与糯米糍的分化系数最小(0.088)，与三月红的分化系数最大 图4的聚类分析同样表明，御金球与糯米糍的亲缘关系最近，来自广西和广东的胭脂红与红灯笼和焦核怀枝首先聚在一起后，才与糯米糍和御金球这一分支聚到一起 2.3 御金球的亲本来源鉴别御金球的亲本来源鉴别 利用17个SNP位点对御金球及其22份疑似亲本进行等位基因型检测 判定亲本的标准为一个位点的二等位基因中，只要有一个等位基因与御金球的相同，该材料即为御金球的推测亲本 从表4（部分）中可以看出，在22份疑似亲本种质中，只有焦核怀枝和红灯笼的17个SNP位点表现为二等位基因或其中一个等位基因与御金球完全相同，因此这两个品种为御金球的推测亲本；其余种质与御金球存在1~12个SNP位点的差异 例如： 此外，在SNP35这个位点上，御金球为杂合型AG，焦核怀枝为AA 从表4可以看出，糯米糍(GG)和红灯笼(AG)在该位点可能成为其另一个亲本的来源，但从起源时间上判断，红灯笼母树树龄远小于御金球母树树龄，因此可排除红灯笼是御金球亲本来源的可能，结合亲缘关系分析，本研究推测御金球是来源于以糯米糍为母本焦核怀枝为父本的有性杂种后代。
3、、讨论讨论 EST-SSR、SNP等分子标记是近年开发的两类特异性强的遗传标记EST-SSR是基于EST文库开发的新型SSR标记，不同于传统的基因组SSR(gSSR)标记，除具有遗传稳定、多态性高、检测迅速和操作简便等优点外，还反映了基因的外显子区段，可以直接获得基因表达的信息，这就有可能对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定SNP即为单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism)，是指由同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或者小的插入缺失等变异所造成的一种DNA序列的多态性 SNP的共显性及二等位的特点使得SNP成为一种较为有效的鉴定品种亲本来源的分子标记技术 分析结果表明，SNP分型技术还需要与品种的起源信息相结合，比如仅从17个SNP位点(表4)看，焦核怀枝和红灯笼均可能为御金球的亲本之一，但却无法判定；从农艺性状如叶片形状上看，二者与御金球都很相似，但从品种的起源信息看，焦核怀枝是一个起源较早的品种，但红灯笼母树树龄尚不足30年属于实生变异，可能为怀枝的自交后代御金球来自于广东省珠海市斗门镇斗门村，其母树应有80年生以上 。
御金球的起源早于红灯笼，红灯笼即不可能为御金球的亲本；由此可以判定，焦核怀枝是御金球的亲本之一 尽管红灯笼不是御金球的亲本，本研究依据EST-SSR和SNP的结果可以推测，御金球与红灯笼可能是姊妹系 那么，御金球到底是由焦核怀枝自交产生，还是其与其它品种杂交产生的后代呢，将二者的SNP位点进行比对发现：在SNP35这个位点上，焦核怀枝为AA，而御金球为AG；；御金球在该位点的杂合型表明其并非是焦核怀枝的自交后代，而是焦核怀枝与其他品种杂交产生 本研究对22个疑似亲本进行比较，发现在SNP35这个位点上，只有糯米糍(GG)和红灯笼(AG)可能成为其亲本来源，但红灯笼已经被排除，所以只有糯米糍成为其亲本的可能性最大，结合EST-SSR和SNP的亲缘关系远近分析，两类标记的结果均表明，御金球与糯米糍的亲缘关系最近因此，本研究认为糯米糍是御金球的母本，焦核怀枝是其父本，并且在SNP24这个位点上御金球发生了突变 谢谢谢谢 。