脊髓灰质炎病毒空斑实验细胞培养• 试验前准备（4人/组） • *无菌操作：套脚套，洗手，个人防护器材 佩戴，包括：衣帽、口罩、手套掌握微 生物学无菌操作技术酒精棉球，无菌镊 子，记号笔等无菌操作过程中要经常用75%酒精消毒手开 瓶盖前也用酒精棉球消毒该区域试管、瓶子的上1/4 ～ 1/3、移液管的下2/3部分不能触碰任何污染区域• 一、传代细胞系培养 • 1、优点：1) 可以无限的传代 • 2) 不少细胞系对病毒很敏感 • 3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培 养，适合病毒抗原的大量生产 • 4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛 刻 • 缺点：在传代过程中可能会遭到支原体和 病毒的污染敏感宿主细胞• 二、传代细胞培养的条件要求 • 1）细胞密度：2～3×105个/ml(Hela 1:3 or 1:4) • 2）pH范围 最适pH7.0～7.4，耐受pH6.6 ～7.8 • 3）培养温度 • 哺乳动物细胞一般为37℃ • 昆虫细胞28～30℃*培养基、分散液的使用• 培养基：①加入双抗使培养基双抗最终浓 度为1%（双抗储备液为104U/ml）；②加 入胎牛血清使其最终浓度为10%； ③加谷 氨酰胺1～2ml于100ml培养基中（使用终 浓度为1～4mmol/L ）；④用7.5%碳酸氢 钠调整培养基为pH7.2～pH7.4，备用。
• 分散液：用7.5%碳酸氢钠调整胰蛋白酶溶 液为pH7.4～pH7.6，备用或直接使用 0.02%EDTA作为分散液培养方法• 1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液 • 2）加入2ml 胰酶消化液或0.02%EDTA(先用5ml 0.02%EDTA 洗1次)，于37℃培养箱放置几分钟 ，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液 EDTA要尽量甩干 • 3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单 个细胞，然后分装于3个小瓶中（1:3）*再在 每个小瓶中补充生长液至10ml～15ml ，然后置 37℃培养箱培养，培养5 ～7天即可长成单层（ 培养板要做好标记）1:3）：转入多孔培养板（6孔板）要计算加入量，2.5ml～3ml/孔每人3孔15ml/瓶×3=45 ml/瓶（ 加16ml吹打，扣除泡沫）Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞正常细胞单层细胞的分散• 注意事项：若所用液体、器材未彻底灭菌 ，可导致细菌或真菌污染，细胞生长缓慢 甚至停止、死亡Hank’s液、病毒悬液、 2×MEM液 体培养基的准备• 加入双抗使Hank’s液双抗最终浓度为1% （双抗储备液为104U/ml）；用7.5%碳酸 氢钠调整Hank’s液为pH7.2～pH7.4 • 用Hank’s液或1×MEM细胞培养基，将 Polio V 1型口服疫苗悬液作系列稀释：10- 1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。
如果怀疑病毒悬液污染，可预先用0.2μm滤膜过滤除菌操作步骤取5g样品振荡 10min45ml4.5ml4.5ml4.5ml 4.5ml 4.5ml0.2ml0.2ml 0.2ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml 0.5ml10-110-210-310-410-510-62ml2ml2ml加培养基2×37℃孵育1.5～2.0 h，每15 min摇动1次• 加入双抗使2×MEM培养基（45 ℃）双抗 最终浓度为1%（双抗储备液为104U/ml） ；加谷氨酰胺1～2ml于100ml培养基中（ 使用终浓度为1～4mmol/L ）；加入胎牛 血清使最终浓度为2%；用7.5%碳酸氢钠 调整培养基为pH7.2～pH7.4，备用 • 将2×MEM液体细胞培养基（胎牛血清浓度 为2%）与1%琼脂糖等量混合，保持在45 ℃ 病毒（PolioV）在传代细胞中的复制• 1、选长满单层的细胞，倒掉（吸出）培养液• 2、接种病毒悬液 0.2 ml/孔，空白对照 加 培养液0.2 ml/孔 • 3、置温箱中置37 ℃吸附1.5～2 h，且每隔15 摇动一次 • 4、然后倒掉（吸出）接种病毒液，铺上45 ℃， 含0.5%琼脂糖的维持液覆盖层，2 ml/孔，置室 温30 min以上。
• 5、凝固后倒置，于37 ℃培养48～72 h空斑观察计数• 于每孔内加入2 ml甲醛固定20 min，然后 甩下琼脂糖覆盖层，用自来水将孔内残渣 轻轻冲洗干净 • 用1%结晶紫溶液覆盖底层，使瓶壁上的细 胞着色10 min ，自来水轻轻冲洗，即可观 察细胞空斑并计数 PFU： 空斑形成单位 (plaque-forming units)； P： 某稀释度计数的空斑数； n： 某稀释度平行培养瓶数； v： 培养瓶接种的病毒液体积•End大肠杆菌f2噬菌体空斑实验一、意义• 由于大肠菌群的生物学特性与肠道病毒之间存在一定差 异，因此用大肠菌群来指示经粪便污染水体的病毒学质 量有其不足之处有研究表明大肠杆菌噬菌体 (Coliphage) f2是一种评价水源污染和水处理过程病毒杀 灭效率的有希望的指示生物，其主要优点是： （1）大 肠杆菌噬菌体 (Coliphage) f2是RNA噬菌体，其核酸性 质、粒子大小、 pH稳定性等均与肠道病毒极为接近 2）大肠杆菌噬菌体经粪便排泄，在水和废水中存在的数 目比肠道病毒多，其数量的季节变化也与肠道病毒相似 3）对外界环境和氯、碘等消毒剂的抵抗力也与肠道 病毒相似或略强一些。
4）大肠杆菌噬菌体的检测与计 数等方法也较简易二、原理• 根据f2噬菌体感染大肠杆菌285宿主菌后， 可在宿主细胞内增殖、最后裂解细胞的特 性，将噬菌体适当稀释，再感染宿主细胞 ，并利用固体琼脂限制单个感染灶的无限 扩散，而形成肉眼可见的空斑一般而言 ，每个空斑即由一个噬菌体增殖裂解而成 ，因此可利用此原理定量检测样品中的噬 菌体数量 病毒数量和感染性测定1、蚀斑试验2、ID50 或 TCID50病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起 50% 发生死亡或病变的最小量病毒感染单层细胞后，产生的局限性病灶（此区域细胞发生溶解），称蚀斑，蚀斑是由 一个感染性病毒体复制形成的，称蚀斑形成单 位，病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升的蚀 斑形成单位PFU来表示三、试剂及培养基制备• 略• 实验分组： 3人/组四、实验步骤• 大肠杆菌285宿主菌增菌培养： 接种1～2 个菌落至10～20 ml营养肉汤液体培养基 中，置37 ℃培养10～12 h，备用• 融化2%营养琼脂固体培养基，将50 ℃左 右营养琼脂倒入平皿，10～20 ml/皿，冷 却凝固待用• 融化小试管中1%营养琼脂固体培养基，置 45 ℃保温，待用。
• 用无菌蒸馏水，将f2噬菌体悬液作系列稀 释：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6， 10-7，10-8 • 对以上平皿，按上述稀释度编号，每个稀 释度3皿平行• 将不同稀释度f2噬菌体稀释液1 ml、285宿 主菌悬液0.2 ml和约45 ℃，1%营养琼脂5 ml，混匀，倒入以上平皿，冷却• 平皿倒置37 ℃培养16～24 h• 观察透明空斑并计数45 ℃， 1%营养 琼脂5 ml f2噬菌体稀释液1 ml菌悬液0.2 ml混匀静置、冷却PlaquePFU： 空斑形成单位 (plaque-forming units)； P： 某稀释度计数的空斑数； n： 某稀释度平行培养瓶数； v： 培养瓶接种的病毒液体积• End操作步骤称取10g土 样振荡 10min90ml9ml9ml9ml9ml 9ml0.1ml0.1ml 0.1ml1ml1ml1ml1ml1ml10-110-210-310-410-510-620ml20ml20ml倒培养基2×CPE病毒培养时出现的CPE电泳（PAGE）鉴定轮状病毒（ Rotavirus）实验•第一次实验•意义 •在腹泻病的病毒病因中，轮状病毒为主要病因，它占整个腹泻病的 1/4。
在经济发达国家，急性肠胃炎住院的婴幼儿中约1/3-1/2以上是 轮状病毒腹泻，而在发展中国家，轮状病毒为主要病因急性腹泻的 病因颇多，往往需要更准确的实验室诊断进行确诊，即从粪便中检测 轮状病毒或其抗原PAGE是轮状病毒腹泻分子流行病学调查和临床 确诊常用的方法 •原理 •轮状病毒RNA由11个片段的双链RNA组成，在一定的pH环境中，分 节段的RNA带负电荷，由于电场力的作用，带负电荷的RNA片段向 正极方向泳动，鉴于各RNA片段本身结构、带电荷不同，因此，在 一定时间内各分子量不同的RNA片段泳动到聚丙烯酰胺凝胶板上特 定的位置，形成各自的致密区带，经硝酸银染色，呈现出RNA区带 电泳图型，从而使RNA片段得以分离和分析• 实验步骤 a)提取RNA (供PAGE电泳用) • 用PBS制备10%的粪便悬液： 0.25 g粪便加入2.25 ml PBS • 取10%粪便悬液250μl于1.5 ml 离心管（编号），加50μl裂解液 震荡器上混匀 （3次） • 37℃孵育30 min临床样本：1、3、4、54. 加入4℃存放重蒸过的苯酚300μl，震荡混匀 （3次） 5. 12000转/ min，离心2 min。
液体分层 6. 吸出上层液体至另一小离心管中（同样编号），不要 扰动中间相和下层液体，弃原离心管 7. 加入氯仿300μl，震荡混匀 （3次） 8. 12000转/ min，离心2 min液体分层 9. 吸出上层液体至另一小离心管中（同样编号），不要 扰动中间相和下层液体，弃原离心管 • 重复4～9步骤1～2次 • 加入-20℃保存的无水乙醇500μl，再加入5 M NaCl 5μl ，盖紧小试管，倒转来回彻底混匀3次20℃静置过夜 ，或-70℃ 2小时以上加氯仿加苯酚取上层混匀离 心混匀离 心取上层第二次实验12.12000转/ min，离心15～20 min 13. 离心后立即倒掉液体，离心管倒立，让 液体控干，下边垫吸水纸，然后将离心管 直立，室温放置15～30 min，待其干燥 （ 让乙醇挥发） 14.每管加入50μl灭菌的双蒸水，溶解RNA ，放-20℃保存，即为PAGE用RNAb) PAGE板的制备和电泳 • 用酒精擦洗两块玻璃板、梳子，用纸擦干 净、凉干组装固定两块玻璃板 • 封底胶：琼脂糖1 g，加热溶解在100 ml双 蒸水，用融化的琼脂糖封住玻璃板的三个 边，以防漏胶。
3. 制备分离胶：0.75 M Tris-HCl (pH 8.8) 20 ml0.1 M EDTA 0.4 ml丙烯酰胺溶液（单体） 13.3 ml双蒸水 4.7 ml • 混匀，加入3%过硫酸铵1.6 ml，TEMED 70 μl 后迅速混匀，立即倒入玻璃板中间，离梳齿1～ 1.5 cm后终止，然后加入双蒸水，直立静置1h左 右制备浓缩胶前，倒掉双蒸水2010年：1.4 ml + 60 μl• Tris (Figure 3) is used to remove ammonia and amine contaminants and to keep the gel at a constant pH. Figure 3 - Tris Molecule Figure 5 - Acrylamide Molecule Figure 6 - BIS Molecule Figure 7 - Ammonium Persulfate (APS) Molecule Figure 8 - TEMED Molecule Figure 9 - Polyacrylamide Matrix 第三次实验4. 。