贴壁细胞培养一、 克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在 体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆 可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间通过克隆形成实验，可对单个细胞的 增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性这种方法常用于抗 癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形 成实验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞材料与方法（一） 用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、 培养液PBS、0.25%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管5- 氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌 生理盐水配制成1Mg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度二） 操作：① .制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用0.25%胰酶消化并吹打成单个 细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3X102 个/mL,接种于12孔板，1000 mL/孔。
PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml 至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100皿到EP管混合，取 10Ml细胞计数倍比稀释（吸出1ml,加2ml培养液吸出1ml,弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液直到需要的细胞数12600个细胞/3ml,或8400个细胞/2ml种板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml细胞，不用摇② .待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000昨，设6组0, 0.33, 0.66 , 1.33 , 2.66, 3.99 4.66瞄/ml药物组，每组2复孔，转染后置37C, 5%CO2饱和湿度条件培养 箱内孵育7天计数：满体积2000ul 其中 药物浓度100ug/ml 100ulNS:0.33 瞄/ml *2000ul =100ug/ml * XX =6.6ul + NS93.4ul N=20.66 瞄/ml *2000ul =100ug/ml * XX =13.2ul + NS 86.8 ul N=21.33 瞄/ml *2000ul =100ug/ml * XX = 26.6ul + NS73.4ul N=22.66 瞄/ml *2000ul = 100ug/ml * XX =53.2ul + NS46.8 ul N=23.99 瞄/ml *2000ul =100ug/ml * XX =79.8 ul + NS20.2 ul N=14.66 瞄/ml *2000ul =100ug/ml * XX =93.2 ul + NS 6.8 ul N=10 100 N=2eg:5-FU 6.6 * 3 + NS 93.4 * 3 mix 在 EP 管中。
等待加药N=2③ .吸去培养液，加入PBS洗涤后，染色，干燥：刘氏染色法加 Liu A Solution 0.5 ml 染色 30 s滴加Liu B Solution 1ml于A液上面，轻吹使其充分混合，染色1 min水洗，干燥、拍照二、细胞传代原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过 大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡为了维持细胞的存活和生长，必须 进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养材料与方法（一） 用品：含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、0.25%胰酶、EP管，细胞培养 瓶二） 操作：① 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，PBS过一遍，加1ml0.25%胰酶消 化并吹打成单个细胞，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一 小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取1^l到EP管混合，取10皿 细胞计数用② 细胞传代：在之前制备的细胞悬液2.5ml中，用滴管吸取1/3滴管至细胞培养瓶，后用 滴管吸取3滴管含10%新生牛血清的RPMI-1640至细胞培养瓶，关紧瓶盖用酒精棉球搽 拭后，放入37C5%CO2培养箱中孵育。
三、MTT比色法原理：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法实验所用的显色剂是一种能接受氢 原子的染料化学名3- （4, 5-二甲基噻唑-2） -2,5-二苯基四氮唑溴盐商品名噻唑蓝， MTT活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的兰紫色结晶物， 并沉积在细胞中而死细胞无此功能二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物， 用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范 围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比与其他检测方法如细胞计数法，3H掺入法，LDH法有良好的相关性材料与方法 （一）用品：1 MTT液：称取250mgMTT,放入小烧杯内，加50ml PBS （0.01M, pH7.4）在电 磁力搅拌仪上搅拌30min用0.22 um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有 效2. 10%新生牛血清的RPMI-1640， 0.25%胰酶，DMSO （分析纯）3. 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌 生理盐水配制成1Mg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度二）步骤1. 接种细胞，用0.25%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。
2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取10ml到EP管中，吹打，计数3. 配5000个细胞/120ul用96孔板，设0, 2, 4, 8, 16, 24瞄/ml组每空 加入120Ml细胞4. 第二天，加入药物40皿5. 培养48h每孔加入MTT （5mg/ml） 20皿，继续培养4兀小心吸弃孔内的上清液6. 每孔加入150皿的DMSO，震荡10min, 570nm测吸光值满体积160ul 其中药物40皿药物浓度100ug/ml（对照组加40MlNS）2pg/ml *160ul = 100ug/ml * XX = 3.2 ul+ NS 36.8 ul4pg/ml *160ul = 100ug/ml * XX = 6.4ul + NS33.6 ul8pg/ml *160ul = 100ug/ml * XX = 12.8ul + NS27.2 ul16pg/ml *160ul = 100ug/ml * X X =25.6 ul+ NS 14.4 ul24pg/ml *160ul = 100ug/ml * X X =38.4 ul+ NS1.6 ul5-FU 3.2 * 4 + NS 36.8 * 4 mix 在 EP 管中。
等待加药CCK-8法步骤1. 接种细胞，用0.25%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100pl到EP管中，吹打，计数3. 配5000个细胞/120ul用96孔板，设0，2， 4， 8， 16， 24瞄/ml组每空 加入120皿细胞4. 第二天，加入药物40皿5. 培养48h每孔加入CCK-8溶液10皿，继续培养30—90min6. 震荡10min，450nm测吸光值。