壳聚糖／海藻酸盐微胶囊固定化酿酒酵母生产乙醇 杨文娟，朱敏莉，齐智涛，刘博，薛伟明 (西北大学化工学院，陕西西安，710069) 摘 要 针对酿酒酵母细胞发酵生产乙醇存在的产物抑制，细胞利用率低，发酵效率低等主要问题，以壳聚糖、 海藻酸钠为微载体制备材料，采用脉冲电场液滴工艺制备载细胞壳聚糖／海藻酸盐微胶囊，以细胞生长量和乙醇 产量为检测指标，对微囊化酿酒酵母生长代谢特性进行研究结果表明，微囊化酿酒酵母呈现“s”型生长，生长 代谢规律与游离培养相似；经过批次培养，最大细胞生物量2．9 X l0 个／mL显著高于游离培养样品1．9 X 10 个／mL，乙醇产量12．6g／L高于游离培养工艺产量10．2g／L正交设计试验表明，壳聚糖分子量是影响微囊化 细胞乙醇产量的显著因素，优化条件组合为壳聚糖分子量5万、壳聚糖浓度2．0 mg／mL、成膜反应时间15 min及 培养基pH 6．0，在此条件下获得乙醇产量为13．5 g／L 关键词 壳聚糖，海藻酸盐，微胶囊，酿酒酵母，乙醇 酒精是重要的工业原料，在食品、化工、橡胶、油 漆涂料、电子、造纸、香料与化妆品等工业行业应用广 泛…酒精生产方法主要有两类：微生物发酵法和 化学合成法 ，其中，采用酿酒酵母发酵生产酒精是 相对经济的方法。
由于酒精是酵母细胞的强毒性代 谢物，发酵液中酒精产物累积将严重抑制酵母细胞的 生长代谢，进而限制酒精产量的提高 ，因此如何 使酿酒酵母在发酵过程中保持较高生长速率、提高酒 精产量，是众多企业与学者研究的重要课题 酵母细胞固定化生产乙醇 可以解决传统游 离发酵工艺中机械搅拌对细胞损伤、细胞利用率低、 产物抑制明显、生产能力低等问题 实现细胞 固定化的技术主要包括吸附、共价交联、凝胶包埋 等 ，但它们的主要问题在于：(1)固定化载体尺寸 过大(通常大于3mm)，难以在发酵容器中稳定悬浮， 营养物和代谓f产物传质效率低；(2)吸附或包埋工艺 制备的固定化细胞，细胞包封率低且易脱落，而共价 交联技术易导致细胞损伤问题本文拟采用脉冲电 场液滴工艺制备载细胞微胶囊，工艺特点为制备条件 温和、工艺简便、固定化细胞活性与包封率高、微米尺 寸载体在发酵容器中可稳定悬浮，更为重要的是，半 透性微囊膜不但为固定化细胞提供了保护性屏障，使 细胞免受发酵过程的机械搅拌损伤，而且还为囊内细 第一作者：硕士(薛伟明教授为通讯作者) 国家自然科学基金资助项目(50373046)；陕西省教育厅专项科 研计划资助项目(07JK386)；西北大学研究生创新基金资助项 目(07YZZ23，08YZZ49)；陕西省“13115”科技创新工程重大科 技专项(2008ZDKG一58)；陕西省重点学科资助项目 收稿日期：2009—03—13，改回日期：2009—05—25 胞提供了相对稳定的生长微环境。
在浓度梯度推动 下，一方面，培养基中营养底物通过微囊膜中微孔向 囊内传递，为细胞生长提供营养；另一方面，囊内细胞 产生的小分子代谢产物也可以通过囊膜不断向外环 境扩散，有效减轻了产物积累对细胞生长代谢的抑 制 本文以天然多糖海藻酸钠、壳聚糖为微胶囊制备 材料，以酿酒酵母为细胞模型，制备包封酿酒酵母的 壳聚糖／海藻酸盐微囊化体系，研究期望在于减轻细 胞发酵过程中的产物抑制，提高微囊化细胞的稳定 性，提高发酵效率，为微囊化酿酒酵母的工业应用提 供理论依据 1 材料与方法 1．1 菌种 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)B184，购自 陕西省微生物研究所菌种保藏中心 1．2原料和试剂 海藻酸钠(化学纯，西安化学试剂采购站)；壳聚 糖(食品级，浙江金壳生物化学有限公司)；蛋白胨 (天津市大茂化学试剂厂)；酵母膏(北京奥博星生物 技术有限责任公司)；葡萄糖(分析纯，郑州派尼化学 试剂厂)；麦芽汁(自制)；其余试剂均为市售分析纯 1．3主要仪器与设备 脉冲电场微球制备仪(自制)；WZ一50C2型注射 泵(浙江大学医学仪器有限公司)；BCM型生物洁净 工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；XDS一1B型 倒置生物显微镜(重庆光电仪器总公司)；722型可见 笙蔓 鲞蔓旦塑(篁蔓 鱼 塑2 J 25 光光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)； SHA—B型数显气浴恒温振荡器(江苏金坛市宏华仪 器厂)；H18314便携式微电脑pH测试仪(北京哈纳 科技有限公司)；HV一5型立式高温蒸汽灭菌锅(日 本HIRAYAWA Manufacturing公司)；5415D Eppen— dorf离心机(北京博益伟业仪器有限公司)；GC7890 型气相色谱仪(上海天美科学仪器有限公司)。
1．4 培养基 斜面保藏培养基：麦芽汁琼脂培养基 种子培养基：麦芽汁培养基¨ 摇瓶发酵培养基：蛋白胨3g／L，葡萄糖30g／L，酵 母膏5g／L，pH5—6 1．5 实验方法 1．5．1 种子培养 挑取斜面保存的酿酒酵母，接种到装有100 mL 种子培养基的250 rnL三角瓶中，30~C、150 r／rain培 养24h 1．5．2 栽细胞壳聚糖／海藻酸盐微胶囊制备 移取5 mL酿酒酵母种子培养液，5 000 r／rain离 心10 rain，收集菌体并加入5 mL、20 mg／mL海藻酸 钠溶液，混合均匀后经脉冲电场微球制备仪滴人100 mL、20 mg／mL CaC1 溶液中，固化15 min制得载细胞 海藻酸钙凝胶珠采用1％(v／v)醋酸溶液配制黏均 分子量5万、2．0 mg／mL壳聚糖溶液，将载细胞凝胶 珠与壳聚糖溶液按体积比1：10混合并反应15 min， 制得载细胞微胶囊实验均在无菌条件操作5．3 酿酒酵母游离培养 无菌条件下，将5 mL酿酒酵母菌种子液接人摇 瓶发酵培养基中，30~C、l50 r／min培养，隔时取样测 定菌浓、耗糖量及乙醇产量 1．5．4酿酒酵母菌微囊化培养 无菌条件下，将载酿酒酵母的壳聚糖／海藻酸盐 微胶囊接入摇瓶培养基中，30℃、150 r／min培养。
隔 时取样，在倒置物显微镜下观察微胶囊形态及囊内细 胞生长情况，读取若干微胶囊粒径，测定菌浓、耗糖量 及乙醇产量 1．6分析方法 1．6．1 细胞浓度测定 游离细胞浓度测定采用光电比浊计数法” ，在 入 测定培养液吸光度值4 利用标准曲线方程 A560=0．016 3×C菌浓一0．013 3(R =0．997 7)计算细 胞浓度测定微囊化细胞浓度时，先采用化学破囊方 法使微胶囊解聚并释放囊内细胞¨ ，再采用光电比 26 I 2 !：曼曼 Q：璺f! ! ! 鱼 2 浊计数法测定 1．6．2微胶囊膨胀度Sw测定 微胶囊膨胀度Sw定义为：Sw=Dt／Do，其中，Do 为微胶囊在发酵初始时刻的平均粒径， 为发酵进 行至t时刻的微胶囊平均粒径，绘制微胶囊膨胀度随 发酵时间的变化曲线 1．6．3耗糖量测定 隔时采集发酵液样品，采用DNS法 测定培养 基中葡萄糖含量 1．6．4 乙醇含量测定 采用气相色谱法测定发酵液中乙醇含量色谱 条件：毛细柱SE一54，柱温80cI=，气化室和检测器温 度为120℃，载气流量(氮气)58 mL／min 1．6．5微囊膜扩散性能测定 称取一定质量的空白壳聚糖／海藻酸钙微胶囊， 置于目标组分初始浓度为C 的扩散介质中，在30℃、 150 r／min恒温摇床中考察目标组分在微囊膜中的扩 散行为。
定时测定t时刻扩散介质中目标组分浓度 c 以ct／c为纵坐标，扩散时间t为横坐标，绘制扩 散曲线 2 结果与讨论 2．1 微囊化对酿酒酵母生长特性的影晌 图1为酿酒酵母游离培养与微囊化培养生长曲 线结果表明，2种培养方式的细胞生长规律相似， 均呈现“s”型生长规律，表明壳聚糖／海藻酸盐微胶 囊培养体系能够维持酿酒酵母的正常生长，具有良 好的生物相容性微囊化细胞生长的对数期略滞后 于游离培养样品，但在稳定期后期，游离培养的细胞 浓度下降，而微囊化培养的细胞浓度在较长时间范围 维持稳定 0 10 20 30 40 50 6O 培养时间／h 图1 游离培养与微囊化培养对酿酒酵母生长的影响 由于多孔结构的海藻酸钙微球及其表面的微囊 膜对物质扩散具有阻力，与游离培养样品相比，微囊 化培养过程中，培养基中营养物质向囊内扩散速率及 6 2 8 4 一 ．IE． 一、 三×卿鐾器 细胞代谢产物向囊外排出速率减小，同时微球内部结 构对细胞生长具有一定的空间限制作用，使微囊化细 胞进入对数期的时间略为滞后，最大细胞生长量较 小但是，在微囊化细胞培养过程中，在浓度梯度推 动下，囊内细胞产生的代谢产物乙醇不断向囊外主体 溶液扩散，使囊内微环境中乙醇累积浓度始终维持在 较低水平，有利于酿酒酵母的长期稳定生长和生产。
2．2微囊化酵母培养对微载体形态的影响 在酿酒酵母微囊化培养过程中，微胶囊粒径随培 养时间的变化关系如图2和图3所示结果表明，新 鲜制备的载细胞微胶囊粒径及囊内细胞密度较小 随着培养时间延长，囊内细胞密度逐渐增大，微囊粒 径增加，在48h培养时间范围内，微囊形态保持完整， 未见细胞从囊中泄漏 1．30 1．25 1．20 1．15 l·10 1．O5 O l0 2O 30 40 50 培养时间／h 图2微囊化细胞培养对微胶囊粒径的影响 一一一一 图3微胶囊内酿酒酵母菌的生长状况(100 x) 在微囊化细胞培养过程中，生长于海藻酸钙多孔 囊内部扩散，随着扩散时间延长，主体溶液中葡萄糖 凝胶囊芯中的细胞数量增加，囊芯孔结构扩张，导致 浓度变化趋于稳定 微囊表观粒径增大但是，由于壳聚糖／海藻酸盐微 胶囊具有良好的黏弹性和柔韧性，细胞数量增加导致 的微囊粒径增大并未引起微囊结构破损，表明本工艺 制备的微胶囊系统适于固定化细胞的长期稳定培养 2．3微囊化培养对细胞代谢特性的影响 微囊化酿酒酵母培养过程中，培养基中葡萄糖消 耗量及乙醇生成量随培养时间变化规律如图4所示 结果表明，与游离培养方式相比，微囊化培养具有相 似的糖耗与乙醇代谢规律，但糖耗速率与乙醇生成速 率较低。
培养时间／h 三 越 藿 图4游离培养与微囊化培养对细胞代谢的影响 图5考察了葡萄糖在微囊膜中的扩散行为，在初 始浓度差的推动下，主体溶液中的葡萄糖迅速向微胶 O l0 20 30 40 50 扩散时间／min 图5 葡萄糖在壳聚糖／海藻酸盐微胶囊中的扩散 作为酿酒酵母生长代谢的微载体，微胶囊表面具 有一层选择透过性膜，膜中微孔结构允许葡萄糖、乙 醇等小分子通过膜自由扩散，实现这些物质跨膜扩散 的推动力为膜两侧组分浓度差在培养过程中，培养 基中葡萄糖浓度高于微囊内部浓度，而囊内细胞代谢 产生的乙醇浓度高于囊外培养基浓度，因此，在浓度 梯度推动下，小分子营养物和代谢产物能够通过微囊 膜传递，保证了囊内细胞的正常代谢尽管微囊膜对 物质传递具有一定阻力，导致微囊化培养体系的葡萄 糖消耗量和乙醇产量都略低于游离培养，但传质规律 与游离培养一致，表明壳聚糖／海藻酸钠微胶囊能够 作为细胞固定化载体进行发酵生产应用 笙蔓 曼鲞蔓 塑(篁蔓 塑 27 l 0 O 0 0 0 ∞ ∞ 加 m 5 一 ． 越蛙罄精糖 2．4微囊化酿酒酵母的批次培养 批次培养条件下，微囊化酿酒酵母最大细胞生物 量和乙醇产量如图6所示。
结果表明，经过连续4个 批次培养后，微胶囊形态完整，最大细胞生物量达到 2．9×10 个／mL，明显高于游离培养细胞量1．9×10 个／mL相应地，第1批次至第4批次培养基葡萄糖 消耗量达到99％时所需时间分别为16、6、3和3 h， 表明逐渐增加的微囊化细胞数量导致批次培养中底 物消耗速率加快 游离批次1批次2批次3批次4 l6 一 l2=j ● 8 、 4让 O 图6批次培养对酿酒酵母最大细胞生物量 和乙醇产量的影响 图6可见，批次培养时乙醇产量高于游离培养方 式，乙醇产量随培养批次增加而增大第4批次培养 的发酵液中，乙醇浓度达到14．。