学号：20081310207毕业设计论文题 目：维氏气单胞菌胞膜制备条件的优化探 索院 系：生命科学技术系专 业：生物工程班 级：2008级生物工程二班学生姓名：导师姓名：2012 年 6 h 1 H1•前言 11.1维氏气单胞菌的简介 12.实验方法及其操作 32. 1 实验流程图 32. 2菌种检测方法及菌种破碎方法 32.3 实验器材 42. 3. 1实验仪器 42.4试剂的配制 62.4. 1 LB营养肉汤的配制 62.5维氏气单胞菌的鉴定 72. 5. 1 菌落形态 72.5.2革兰氏染色 72.5.3维氏气单胞菌分了鉴定 72.6 结果分析判定 72. 10 操作方法 93 实验结果 11参考文献 18致谢 20摘要：目的鱼类细菌性败血症（俗称爆发性鱼病）病原为嗜水气单胞菌，而维氏气单 胞菌是嗜水气单胞菌的一种类似致病菌，同样危害讎、鲫、编、備等多种淡水养殖鱼类，造 成养殖鱼类大批死亡制备防止该病发生的疫苗是防止该病发生的有效手段而传统的注射 法疫苗和浸泡法疫苗耗工费时•，不利于生产推广，使用口服疫苗是解决上述问题的有效手段木研究致力于为取得一种便于T•业操作的，且具有高安全性和免疫原性的口服疫苗制备 提供条件。
由于维氏气单胞菌细胞膜蛋白具备强烈的致病抗原性，且生物膜疫苗由于没有完 整细菌而具备较高的生物安全性本研究拟通过从病鱼中分离出致病菌株，然示通过超声破 碎的方法制备生物膜口服疫苗，探索出一条具冇高细胞破碎率且同时能保持菌体胞膜保持高 抗原性的超声破碎方法是木研究的主要目的木研究通过不断地摸索，通过单一变量的方法 设定不同的超声破碎时间，间隔时间以及不同的菌体浓度探索出一个最适宜的超声破碎方法设定标准浓度川超声波破碎的方法将菌体破碎，用显微镜镜检的方法测定破碎率，为后 续提供材料并为工业制备维氏气单胞菌膜外蛋白疫苗提供技术支持关键词：细菌性败血症；嗜水气单胞菌；维氏气单胞菌；超声波，镜检，考马斯亮蓝，被膜蛋白Abstract： Objective： Fish bacterial sepsis which pathogen is Acromonas hydrophila,harm fish of fresh water aquiculture including silver carp,crucian carp,bream,Bighead carp etc. cause fish large quantities of death.From water sample and soil which pollution of fish bacterial sepsis isolated pathogenic strain and biochemical appraisal. The strains were cultured with biological methods,Production of bacterial suspension Set the standard concentration of bacterial broken ultrasonic method,Fragmentation rate determined by the method of microscopic examination,Determination of Aeromonas hydrophila for the follow-up by Coomassie blue staining (broken) envelope protein determination of the material・ In this study, continue to explore^ By the method of a single variable setting a different sonication time intervals and different cell concentration to explore one of the most suitable sonication method.Set the standard concentration using ultrasonic bacterial broken, broken rate determined by the method of microscopic examination for the follow・up materials and Vickers Acromonas outer membranc protein vaccine to provide technical support for the industrial preparatioruKey words： Fish bacterial septicemia;Aeromonas hydrophila; Vickers Aeromonas； Ultrasonic cell,Microscopic exam in atio n, Coomassie brilliant blue staining, Tegume nt protein1•前言维氏气单胞菌(Vickers Aeromonas )在H然界分布广泛，普遍存在于淡水、污水、淤泥、 土壤和人类粪便中，是一种条件致病菌，对水产动物、畜禽和人类均有致病性，是一种典型 的人■兽■鱼共患病原菌⑴，可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻，给人类的健康带来了威 胁，同时也给养殖业造成较大的经济损失，已引起了国内外水产界、兽医学界和医学界的高 度重视。
1.1维氏气单胞菌的简介1.1」分类地位 维氏气单胞菌属于弧菌科(Vibrionaceae)气单胞菌属(Aeromonas)根据有 无运动力可将气单胞菌属分为嗜冷性、无运动力的嗜冷气单胞菌(Psy2chrophilic group)和嗜 温性、有运动力的嗜温气单胞菌(Mesophilic aeromonad )两类气单胞菌群维氏气单胞菌属 于笫二类，是气单胞菌中最重要的一种，是气单胞菌属的模式种，它又可分为三个亚种:嗜水 亚种(A. hydrophila),不产气亚种(A. hydrophilaanaerogenes),解氨亚种(A. hydro phi la proteoly tica),前两种是赖氮酸脱竣酶阴性，后一种是赖氮酸脱竣酶阳性运用同工酶技术和DNA・ DNA杂交技术，并结合生物型将气单胞菌展分为14个DNA(Deoxyribonucleic acid)杂交群 (DNA hybridization group, DHG),维氏气单胞菌屈于DHG1・21.1.2生物学性状维氏气单胞菌是兼性厌氧的革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆，肓或略弯， 单个或成双排列，大小为0.3・1.0gxl.0・3.5pn,无荚膜，不产生芽抱。
电了显微镜下可见极 端单鞭毛，部分侧鞭毛〔2】，有运动力木菌营养要求不高，专性需氧，生长温度5 °C-40 °C, 最适温度28 °C, pH6-ll,最适为pH7.2⑶维氏气单胞菌在普通营养琼脂培养基上生长良好，形成圆形、边缘整齐、中央隆起、表 面湿润、光滑、半透明、颜色由灰白色至浅黄色的菌落，并有特殊芳香气味菌落大小因培 养时间及温度而异，菌落小的仅有针尖大小，大的肯径可达2〜3 mm大多数菌株有血溶性,在血琼脂平板上生长吐盛且形成清晰的卜溶血环1.1.3致病性 维氏气单胞菌广泛存在于淡水、污水及土壤有很多资料记载，维氏气单胞 菌对水产动物、家畜和人均有致病性，在动物疾病学和食品卫生学研究上都具有重要意义 它能广泛地被分离到，如在淡海水鱼，淡水虾类，淡水蟹类中和养殖蛙体内，也能引起爬行 类疾病有许多报道证明它也能感染人类发病，最常见的是维氏气单胞菌引起的急性霍乱 同时，它广泛分布于人类的食物链，供水系统和土壤中维氏气单胞菌既是恒温动物与变温动物的条件致病菌，乂是原发致病菌但是，AUSTIN 等报道维氏气单胞菌通常在白然界是条件致病菌，充当继发病原而不是原发病原维氏气单胞菌通常与其它病原菌如温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌和假单胞菌有密切关系, 但由于鱼的品种不同而表现岀不同的临床症状。
病鱼的临床症状为局部损伤、坏死、水肿、 突眼及腹部膨胀，另外可能产生腹水、贫血及破坏内脏器官，脾、肾颜色变黑，肝变白，肌 汁变黄在鱼、蛙类中由于维氏气单胞菌感染引起的临床症状不同而给出了许多不同的名称, 如鲂鱼和鲤鱼的“红痛病二鲫鱼、白籬、花籬的“暴发病J这些鱼出现典型的肌肉、内脏的 出血性败血症在虹鱒，鲍鱼中的维氏气单胞菌病被称为“坏死病=这些鱼的嘴周I节I鳞片腐 蚀，身体的深部出现坏死及烂鲍虹鱒鱼rfl于维氏气单胞菌的感染而得的病称为“红嘴病二 病鱼行动迟缓，通常由于色素的过量产生而体色发黑，口腔呈粉红或红色发炎，外表及内部 器官均呈现局部出血，在病鱼的示期阶段，病鱼呈急速螺旋状运动，下沉，腹部朝上直至死 亡红腿病''蛙的后肢及腹部呈现出血性败血症，病蛙的心、肝、肾及脾受到破坏，并岀现 腹水1.1.4致病源 维氏气单胞菌生物被膜蛋白表达强烈的致病性，提取维氏气单胞菌膜外蛋 白，并将此蛋白以口服或注射的方法对鱼或小鼠进行免疫，筛选适宜浓度使鱼或小鼠产生免 疫抗性，达到免疫效果，并将此方法推广到工业化生产上，为鱼的维氏气单胞菌致病提供疫 苗 122]2•实验方法及其操作2.1实验流程图2.2菌种检测方法及菌种破碎方法2.2.1菌种检测方法(1 )革兰氏染色法(制片、初染、媒染、脱色、复染、镜检)将冻存菌种扩大培养，挑 取单菌落用革兰氏染色法进行染色，进而镜检，所需维氏气单胞菌形态为红色短杆状。
2 )维氏气单胞菌16s rDNA检测 将制好的菌悬液提取DNA , PCR扩增，然后进行琼 脂糖凝胶电泳，紫外荧光下拍照检测，进行16s rDNA基因的长度分析2.2.2蛋白质标准曲线的绘制用考马斯亮蓝染色蛋白的方法测绘岀蛋白质标准曲线 将配制好的标准浓度蛋白质稀释 六个梯度做3个平行，用分光光度计测绘出在A595nm处的吸光值，并处理数据测绘出蛋白质浓度标准曲线223菌种破碎方法将制好的菌悬液在冰水混合条件下用超声破碎仪超声破碎2.2.4菌种破碎率的检测（1） 显微镜直接计数法显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的 具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌板），于显微镜下直接计数细菌的一种简便、快速、 直观的方法将破碎前以及破碎10、20、30、40、50、60个循环时的菌悬液分别滴到血细胞 计数板上计数并计算破碎率2） 平板培养计数法 平板培养计数是根据微生物在高度稀释条件下，其在【司体培养基 上所形成的单个菌落是由一个细菌繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表 一个细菌计数时，首先将待测样品进行系列稀释，尽量使样品中的细菌分散开，使成单个 存在（否则一个菌落就不只代表一个细菌），再取一定稀帑度、一定量的稀释液接种到平板中， 使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由一个细菌生长繁殖形成单个菌落，统计菌 落数目，即可计算出样品中的菌数将破碎前以及破碎10、20、30、40、50、60个循环时的 菌悬液稀释合适倍数分别涂布到已配制好的平板上培养，计数并计算破碎率2.3实验器材2.3.1实验仪器主要仪器：表1仪器规格及厂家仪器型号厂家DHG-9030A型恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司VS-840K-U型洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司 ZDX-35SBI型坐式自动电热。