实验 血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定 【实验目的】 1.熟悉蛋白质分离提纯的技术路线 2.掌握盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析等实验原理及操作技术 【实验原理】 血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α_1 -球蛋白、α_2 -球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白室一类结构及功能相似的蛋白质，绝大多数免疫球蛋白属于γ-球蛋白，因此γ-球蛋白的分离纯化在医学研究中非常重要 蛋白质的分离纯化室研究蛋白质结构及其生物功能的重要手段 分离提纯γ-球蛋白时， 首先利用各种清蛋白在中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，因为中性盐可使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定因素去除而沉淀 半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，而 33%的饱和硫酸铵溶液只能使γ-球蛋白沉淀，α-球蛋白和β-球蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有γ-球蛋白的醋制品 用盐析法分离而得的γ-球蛋白中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此必须去除常用的方法有透析法、凝胶层析（凝胶过滤）法等本实验采用凝胶层析法， 其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异将蛋白质与无机盐分离。
当溶液通过 SephadexG-25 凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在凝胶柱中会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的 脱盐后的蛋白质溶液可能仍含有其他球蛋白，利用它们等电点的不同，通过DEAE （二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析可进一步分离、纯化出γ-球蛋白 因为α-球蛋白、 β-球蛋白的 pI﹤6.0； γ-球蛋白的 pI 为 7.2 左右因此，在 pH6.3 的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同，经 DEAE 纤维素进行阴离子交换而被结合；而带正电的γ-球蛋白则不能与 DEAE 纤维素进行交换结合从而直接从层析柱流出由于随洗脱液流出的只有γ-球蛋白，从而使γ-球蛋白粗制品被纯化 【实验试剂】 1.免疫血清 2.饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵（ammonium sulfate)850g 于 1000 mL 蒸馏水中，在 70~80℃水浴中搅拌溶解，用浓氨水调 pH 为 7.2，室温放置过夜，瓶底析出白色结晶，上层液即为饱和硫酸铵溶液 3.pH 7.2 磷酸盐缓冲液 （phosphate-buffered saline， PBS)： 称取 NaH2 PO4· 2H2 O 1.56 g，溶于 1000 mL 蒸馏水中，即为 0.01 mol/L NaH2PO4液。
称取 Na2 HPO4·12H2 O 3.58 g，溶于 1000 mL 蒸馏水中，即为 0.01mol/L Na2 HPO4液取 0.01 mol/LNaH2 PO4 液 280 mL，加 0.01mol/L Na2HPO4液 720 mL，混匀即为0.01 mol/L，pH 7.2 磷酸盐缓冲液 4.葡聚糖凝胶 G-25（Sephadex G-25)：按每 100 mL 凝胶床体积需要葡聚糖凝胶 G-25 干胶 25g 称取所需量置于锥形瓶中 每克干胶加入蒸馏水约 30 mL，用玻璃棒轻轻混匀，置于 90~100℃水温中时时搅动，使气泡逸出1h 后取出，稍静置，倾去上清液细粒也可于室温中浸泡 24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸馏水洗涤 2~3 次，然后加 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡，备用 5.奈氏试剂（Nessler“s reagent)： ① 贮存液：称取碘化钾(KI) 150g、碘 110g、水 100ml，移入 250mL 锥形瓶 中，再加入汞 150g，分别摇荡 10~15 分钟，至碘完全溶解，此时溶液温度逐渐升高，由红色变为浅棕色，将锥形瓶置于流水下冷却，继续摇荡，至溶液为米黄色为止，倾入溶液置 2000ml 容量瓶中，将沉淀用水多次洗涤倾入瓶中，然后加水 2000ml 刻度，混匀。
② 应用液：倒上述溶液 30ml，加入 10％NaOH 140mL，加水 30mL 混匀，即为奈试试剂（奈试试剂的主要成分室碘化钾汞复盐） 6.双缩脲试剂 硫酸铜 250g 加水 100ml，加热助溶，取酒石酸钠钾 10g、碘化钾 5g 溶于 500ml 水中， 再加 20% NaOH 30ml， 混匀， 然后将硫酸铜溶液倾入，加水至 1000ml 7.浓蔗糖溶液—饱和蔗糖溶液 8.DEAE-32(二乙基氨基乙基-32） 纤维素的处理： 按 100ml 柱床体积需 DEAE纤维素 14g 称取，每克加 0.5mol/L 盐溶液 15ml，搅拌放置 30min（盐酸处理时间不可太长，否则 DEAE 纤维素变质） 加约 10 倍量的蒸馏水搅拌，放置片刻， 待纤维素下沉后， 倾弃含细微悬浮物的上层液 如此反复数次 静置 30min，虹吸去除上清液（也可用布氏漏斗抽干） ，直至上清液 pH﹥4 为止加等体积1mol/L 氢氧化钠溶液， 使最终浓度约为 0.5mol/L 氢氧化钠， 搅拌后放置 30min，以虹吸去除上层液体 同上用蒸馏水反复洗至 pH﹤7 为止 虹吸去除上层液体，然后加入 0.0175mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.3）平衡，备用。
9.0.0175mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH6.3） 10.20%磺基水杨酸溶液 11.电泳所需试剂 【实验步骤】 1.盐析 ⑴ 取正常人血清 1.0 mL 加入离心管中，加磷酸盐缓冲液（PBS)1.0 mL 稀释血清，混匀再逐滴缓慢加入 pH 7.2 饱和硫酸铵液 2.0 mL，边加边摇匀静置 10 分钟后离心（4000 rpm×10 分)，小心将上清液（此液中主要含清蛋白)倾入试管中（留供后面实验用） ，并尽量倒净，沉淀为球蛋白 ⑵ 将上述离心管中的沉淀用 0.5 mL PBS 溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵液0.25ml，混匀，静置 10 分钟后离心（4000 rpm×10 分钟)，倾去上清液（此液中主要含α、β-球蛋白)并尽量倒净，其沉淀为初步纯化的γ-球蛋白(如要获得更纯的γ-球蛋白，可重复此过程 1~2 次） ，最后用 5 滴 PBS 将沉淀溶解 2. 脱盐 ⑴ 装柱：取层析柱（Φ1×20cm)，关紧下端出口，加蒸馏水少许，缓慢加入已经备好的葡聚糖凝胶 G-25 悬液， 待底部沉积 1~2 cm 厚的凝胶后， 打开下端出口，继续加入凝胶至凝胶沉淀 10~15 cm 高（注意凝胶装填均匀，若分多次加入凝胶应在放胶前将柱内凝胶顶部搅动悬起，再将凝胶液倾入，凝胶床表面应平整且液面始终高于凝胶面） ， 凝胶柱经 PBS 流洗平衡后用螺旋夹调节 PBS 缓冲液的流速，控制在每分钟 6 滴。
⑵ 上样与洗脱：用滴管吸出γ-球蛋白液，将滴管插入层析柱内，在缓冲液几乎全部进入凝胶层时，管口靠近凝胶面缓慢滴入 3 滴蛋白质液，待全部蛋白质液进入凝胶层后，小心用滴管轻轻靠近凝胶面加入 PBS 缓冲液 10 滴，待进入凝胶柱床后再加入 PBS 缓冲液 10 滴，如此重复三次（注意不要破坏凝胶床表面的平整） ，再陆续小心加入 PBS 缓冲液 5~10ml，保持液面始终高于凝胶面洗脱流速始终控制在 6 滴/分 ⑶ 收集： 完成上样后立刻收集洗脱液， 弃 50 滴后 （根据凝胶柱长短而定） ，用事先已经编号的干净小试管，每管收集凝胶洗脱液 10 滴，分别进行检测 ⑷ 检测：准备干净的反应板 2 块，每块反应板各孔依次各加入各管收集的液体 1 滴，然后在一块反应板每空再加入双缩脲试剂 1 滴，观察双缩脲反应的呈色深浅，用（－） 、 （+） 、 （+++）表示另一块反应板每孔各加入奈氏 1 滴， （检查 NH4+存在，呈黄色到橙色，记录下各孔的颜色变化 合并球蛋白含量高的各管溶液，混匀用 DEAE 纤维素阴离子交换柱进一步纯化；少量用作电泳鉴定 附录：透析脱盐：为另一种脱盐方法，与凝胶过滤比较，可供选择。
取玻璃纸（15×15cm）一张，折成袋状将前面第一次盐析得到的含清蛋白上清液倾入袋内，用线绳缚紧上口，用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的 100ml 烧杯内，使透析袋下部浸入水中将杯放置 1 小时以上，(中间换水 1~2 次） ，然后将透析袋取下，小心将线绳解开，用滴管吸出袋内液体放入干净试管中，用双缩脲试剂检查袋内液体有无蛋白质再用奈氏试剂检查袋内、外液体的 NH4+，透析袋法除盐的效果，这种方法亦用于其他蛋白质（如γ-球蛋白）的脱盐 3. 进一步纯化γ-球蛋白 DEAE 纤维素阴离子交换层析：用 DEAE 纤维素装柱约 8~10cm 高度，并用 0.0175mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.3）平衡，然后将脱盐后的γ-球蛋白溶液缓慢加于 DEAE 纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱，分管收集用 20%磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况 （装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检查等操作步骤基本同凝胶层析) 4. 浓缩 (1) 经 DEAE 纤维素阴离子于交换柱纯化的γ-球蛋白溶液往往浓度较低为便于鉴定，常需浓缩收集较浓的纯化的γ-球蛋白溶液 2ml，按每 ml 加0.2~0.25g Sephadex G-25 干胶，摇动 2~3min，3000r/min 离心 5min。
上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液 (2)取玻璃纸一张，同上法将前面纯化的γ-球蛋白溶液放入透析袋内，悬于盛有 10ml 浓蔗糖或聚乙醇溶液的小烧杯内，同样放置 1 小时以上，观察袋内液体体积的变化，小心收集袋内液体入小瓶内，置冰箱保存供以后实验用 5. 鉴定 用上述方法分离得到γ-球蛋白是否纯净、 单一， 可通过电泳比较而鉴定之取三张醋酸纤维素薄膜，分别以原血清、脱盐后（步骤 2）的γ-球蛋白浓缩液和进一步纯化后的γ-球蛋白浓缩液点样进行电泳，如果电泳图谱上只有γ-球蛋白区带，说明γ-球蛋白溶液纯度高 【注意事项】 1. 装柱是层析操作中最重要的一步为使柱床装得均匀，务必做到凝胶悬液或 DEAE 纤维素混悬液不稀不厚，装柱后经检查合格再使用 2. 整个层析操作过程中始终保持液面高于层析柱，切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果 3. DEAE 纤维素阴离子交换层析是利用γ-球蛋白的等电点与α-、 β-球蛋白不同， 用离子交换层析法进行分离的 因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确 4. 凝胶存储： 凝胶使用后如短期不用， 为防止凝胶发霉可加防腐剂如 0.02％叠氮钠，保存于 4℃冰箱内。
若长期不用，应脱水干燥保存脱水方法：将膨胀凝胶用水洗净 用多孔漏斗抽干后， 逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若干时间，最后一次用 95％乙醇溶液浸泡脱水， 然后用多孔漏斗抽干后， 于 60~80℃烘干贮存。