10期 尹逊河等：兔脑nNOS阳性神经元的形态、结构和分布 2121兔脑nNOS阳性神经元的形态、结构和分布尹逊河，王树迎，邱建华，蔡玉梅，刘 燕，王传宝 (山东农业学动物科技学院，泰安 271018)摘要：【目的】探讨兔脑神经型一氧化氮合酶(nNOS)阳性神经元的形态、结构和分布方法】利用SABC免疫组织化学方法，对各年龄段家兔(仔兔、幼兔、青年兔、成年兔、老年兔)整个脑内nNOS阳性神经元进行观察，用网形和尺形测微尺计数和测量各脑区阳性神经元的密度、胞体直径、第一级突起数及最长突起长度结果】（1）家兔的各个脑区均有nNOS阳性神经元和神经纤维出现,其中在大脑皮质、小脑皮质、下丘脑、中脑和脑桥广泛分布，延髓分布极少；（2）nNOS阳性神经元呈深棕色，着色主要在胞质内，细胞核不着色或淡染神经元胞体形态多种多样，有三角形、圆形、椭圆形、梭形等，神经元突起有一个或者数个nNOS阳性神经纤维大多呈棕色串珠样，有些区域的阳性纤维相互交织成网状结论】nNOS阳性神经元，在仔兔时就已基本发育到成年兔水平，以后随着年龄增长逐渐发育成熟至衰老，到2岁龄（老年兔）时就出现了显著的衰老变化，即密度减小，表达强度减弱，第一级突起数减少，最长突起长度变短等。
结果显示：nNOS阳性神经元及其催化产生的NO在家兔中枢神经系统的发育和神经调控中起重要作用关键词：兔脑；神经型一氧化氮合酶；神经元；结构；分布；免疫组织化学Morphology and Distribution of nNOS-Positive Neurons in the Brain of Rabbit YIN Xun-he，WANG Shu-ying，QIU Jian-hua，CAI Yu-mei，LIU Yan，WANG Chuan-bao(College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Taian 271018)Abstract: 【Objective】 The objective was to study the morphology, structure and distribution of nNOS-positive neurons in the rabbit brain. 【Method】 The study observed the nNOS-positive neurons in the whole brain of rabbits of various ages (the young rabbit, juvenile rabbit, youthful rabbit, grown rabbit, aged rabbit) using SABC immunohistochemistry. Researchers counted and measured the density of the NOS-positive neurons in the areas of the brain, the cell soma diameter, the primary process number and the length of the longest process with reticular and ruler-shaped micrometer. 【Result】 (1) nNOS-positive neurons and nerve fibers occured in all areas of the rabbit, especially extensively distributed in cerebral cortex, cerebellar cortex, hypothalamus, mesencephalon and pons, while rare in the medulla oblongata. (2) nNOS-positive neurons appeared dark brown, staining mainly in the cytoplasma while nucleus was not stained or even lightly stained. The morphology of the soma of neurons were various shapes, such as triangle, round, elliptic and fusiform. There were one or several processes in the neuron. nNOS-positive nerve fibers mostly were brown and showed likeness to a string of beads. Positive nerve fibers in some areas interlaced into reticular formation.【Conclusion】 nNOS-positive neurons basically developed to the level of the grown rabbits when they were still young rabbits. Later with aging they gradually developed mature until remarkable decrepit changes occured at the age of 2 years (aged rabbit). That is, the density decreased, the intensity of expression weakened, the number of the primary processes decreaseed, and the length of the longest process shortened. The results showed that nNOS-positive neurons and NO catalyzed to play important roles in the development of the central nervous system and the nerve regulation in the rabbit.Key word: Rabbit brain; Neuronal nitric oxide synthase (nNOS); Neurons; Structure; Distribution; Immunohistochemistry0 引言【本研究的重要意义】近年来的研究表明，一氧化氮（nitric oxide，NO）是神经系统中一种新型的神经递质和信使分子，参与信息传递、神经发育、介导兴奋性毒性、调节神经再生和脑血流量等许多重要过程[1~7]。
NO 是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）催化L-精氨酸产生的[4~6，8]前人研究进展】自从Hope等[9]提出神经元性NADPH-黄递酶（NADPH-d）就是NOS后，国内外学者便纷纷用酶组织化学和免疫组织化学方法研究NOS在神经系统内的分布在神经系统，NOS 共有3种类型[10]：第一种为神经型NOS（nNOS），主要存在于大多数神经元中；第二种为内皮型NOS（eNOS），主要存在于脑血管内皮细胞和海马神经元中；第三种为诱导型NOS（iNOS），一般在病理状态下才诱导产生本研究切入点】有关NOS在大鼠脑内分布的研究报道较 多[10~17]，而在兔脑内的分布研究还未见系统的文献报道拟解决的关键问题】本文利用SABC免疫组织化学方法，首次对各年龄段(从出生到老年)家兔整个脑内nNOS阳性神经元的形态、结构和分布进行系统研究，为全面揭示兔脑nNOS阳性神经元的生长发育规律，探讨NO在家兔中枢神经系统中的作用和作用机制，为神经生物学研究提供科学依据1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验动物 哈白兔50只，均购自山东泰安北集坡养兔场。
根据年龄把试验兔分为5组: 即30日龄以内的仔兔、3月龄的幼兔、6月龄的青年兔、12月龄的成年兔，24月龄的老年兔，每组10只，雌雄各半1.1.2 主要仪器与试剂 Leica CM1850型冰冻切片机（德国Leica公司）；Olympus光学显微镜及显微摄影系统（日本Olympus公司）；网形测微尺和尺形测微尺（上海华岩仪器设备有限公司）；nNOS一抗、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（均购自武汉博士德生物工程公司）1.2 试验方法1.2.1 试验兔处理 本试验基本按照刘曾旭和肖 明[11,12]介绍的方法进行脑组织的取材与固定将试验兔耳缘静脉注射20%的氨基甲酸乙酯（5 ml·kg-1体重）麻醉，打开胸腔经主动脉灌注0.9%的生理盐水100～300 ml以冲洗血液，然后灌注4%的多聚甲醛（4℃），持续0.5～2 h灌注完毕立即取出脑组织，浸在相同的固定液中固定3～5 h后，然后置于20%蔗糖（用pH 7.4的磷酸缓冲液配制）中至组织沉底用上述方法处理的脑组织，沿正中矢状面纵切成2部分，一部分用经生理盐水浸泡过的医用纱布包裹，放进液氮罐中速冻，以备切片用，另一部分放在 -70℃低温冰箱内，作当时切片用。
1.2.2 冰冻切片 将脑组织样块从低温冰箱或液氮罐中取出，做冰冻连续切片仔兔、幼兔、青年兔的脑组织，先沿正中矢状面做纵的连续切片（可由后向前观察到延髓、脑桥、小脑、中脑、间脑、大脑等脑的全貌），再按各个脑区做冠状连续切片成年兔、老年兔的脑组织，先将各脑区分开，再按不同脑区做纵、冠状2种连续切片切片厚度为20～25 μm，切片时温度控制在-15～-10℃间隔3片取1片，裱片后收集于4℃冰箱中晾干1.2.3 染色程序 基本按照李秋明和党双锁介绍的SABC（链霉亲和素－生物素－酶复合物）免疫组织化学方法[14, 18]进行染色染色程序为：0.3％H2O2甲醇溶液，室温浸泡30 min,以灭活内源性过氧化物酶；蒸馏水洗3次→正常羊血清封闭，室温20 min→适当稀释的兔源nNOS抗体（一抗）孵育，37 ℃ 1 h左右→生物素化羊抗兔IgG（二抗）孵育，20～37℃ 30 min（以上两步之后均用0.1 mol·L-1 PBS洗2 min×3次）→SABC工作液孵育，20～37℃ 30 min；0.1 mol·L-1 PBS（pH 7.4）洗5 min×4次→DAB（二氨基联苯胺）室温下显色（镜下控制反应时间，一般在5～30 min之间。
呈色反应为棕色的示为阳性）→苏木素轻度复染→上行梯度乙醇脱水→二甲苯透明→中性树胶封片阴性对照的脑切片，以PBS代替兔源nNOS抗体，其他步骤同上1.2.4 观察、测量和摄影 在Olympus显微镜下观察nNOS阳性神经元的形态、结构，用网形和尺形测微尺计数和测量阳性神经元的密度、胞体直径、第一级突起数及最长突起长度，并进行显微摄影1.2.5 数据处理 所得数据均用EXCEL和SPSS软件进行统计分析 2 结果与分析2.1 兔脑nNOS阳性神经元的整体分布及形态、结构特征 家兔的各个脑区均有nNOS阳性神经元和神经纤维出现,其中在大脑皮质、小脑皮质、下丘脑、中脑和脑桥广泛分布，延髓分布极少nNOS阳性神经元呈深棕色，着色主要在胞质内，说明nNOS是一种胞质酶，细胞核不着色或淡染；神经元胞体形态多种多样，有三角形、圆形、椭圆形、梭形等，神经元突起有一个或者数个；nNOS阳性神。