第二章第二章愈伤组织培养愈伤组织培养主要教学内容主要教学内容n n愈伤组织的诱导与分化愈伤组织的诱导与分化n n愈伤组织的继代培养愈伤组织的继代培养n n愈伤组织的形态发生及调控愈伤组织的形态发生及调控n n愈伤组织培养的应用愈伤组织培养的应用愈伤组织一、愈伤组织的诱导与分化一、愈伤组织的诱导与分化n n愈伤组织，原是指植物受伤之后于伤口表面形成愈伤组织，原是指植物受伤之后于伤口表面形成 的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指外植体的的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指外植体的增生细胞产生的一团不规则、疏松的薄壁细胞增生细胞产生的一团不规则、疏松的薄壁细胞n n一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织n n由外植体形成愈伤组织，标志着组织培养的开始由外植体形成愈伤组织，标志着组织培养的开始 愈伤组织的形成条件愈伤组织的形成条件n n一个成熟的植物细胞经历了脱分化之后，一个成熟的植物细胞经历了脱分化之后， 之所以还能再分化而形成完整的植株，是之所以还能再分化而形成完整的植株，是 因为这些细胞具有因为这些细胞具有全能性全能性n n外植体的选择与灭菌外植体的选择与灭菌植株茎的切段、叶、根、花和种子，或把其中的某些组植株茎的切段、叶、根、花和种子，或把其中的某些组织切成片或块状等均可作为外植体。
织切成片或块状等均可作为外植体n n植物生长调节物质植物生长调节物质通常情况下，诱导愈伤组织的培养基中都含有较高浓度通常情况下，诱导愈伤组织的培养基中都含有较高浓度的生长素的生长素( (如如2,4-D)2,4-D)和较低浓度的细胞分裂素和较低浓度的细胞分裂素( (如如6-BA)6-BA)n n愈伤组织诱导成败的关键主要受外植体的类型及培养基组愈伤组织诱导成败的关键主要受外植体的类型及培养基组成，特别是激素的种类和浓度水平的影响成，特别是激素的种类和浓度水平的影响1 1、植物愈伤组织的形成结构、植物愈伤组织的形成结构n n根据愈伤组织的性质和细胞组成的特点，可以将根据愈伤组织的性质和细胞组成的特点，可以将 它们的结构分为它们的结构分为致密致密和和松散松散两种类型两种类型致密型松散型2 2、、愈伤组织形成的过程愈伤组织形成的过程n n外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下 通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为四个时期，即分为四个时期，即诱导期诱导期、、分裂期分裂期、、形成期形成期和和分分 化期化期。
诱导期诱导期：：n n是细胞准备进行分裂的时期是细胞准备进行分裂的时期n n特点：代谢活化了，细胞内的合成代谢迅速进行特点：代谢活化了，细胞内的合成代谢迅速进行，但细胞的大小和外植体时一样，没有多大改变，但细胞的大小和外植体时一样，没有多大改变 诱导期的长短：诱导期的长短：n n由一系列内部（植物种类、生理状况）和外部因由一系列内部（植物种类、生理状况）和外部因 素（光照、外源激素）决定素（光照、外源激素）决定n n例如菊芋的诱导期有时还不需要例如菊芋的诱导期有时还不需要1 1天，胡萝卜的诱天，胡萝卜的诱 导期则要好几天，但菊芋块茎经过导期则要好几天，但菊芋块茎经过5 5个月的贮藏后个月的贮藏后 ，诱导期则须延长到，诱导期则须延长到40h40h以上n n可以从内外因两方面着手，改变诱导期长可以从内外因两方面着手，改变诱导期长 短短n n外因：添加生长激素如外因：添加生长激素如2,42,4－－D D来刺激处于来刺激处于 静止状态的组织静止状态的组织分裂期分裂期n n是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞 的过程n n外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅 速分裂，使细胞脱分化。
速分裂，使细胞脱分化n n在细胞分裂期，其形成结构和生理生化都发生深在细胞分裂期，其形成结构和生理生化都发生深 刻的变化：刻的变化：n n1.1.数目迅速增加数目迅速增加n n2.2.平均鲜重下降平均鲜重下降n n3.3.体积小，内无液泡体积小，内无液泡n n4 4．核和核仁增大到最大．核和核仁增大到最大形成期形成期n n是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结 构的愈伤组织的时期构的愈伤组织的时期n n这一时期愈伤组织内细胞的特点是：这一时期愈伤组织内细胞的特点是：①①大而不规则，高度液泡化，整个组织是比较松大而不规则，高度液泡化，整个组织是比较松散的②②细胞增殖速度快细胞增殖速度快, ,适合用液体培养或悬浮培养适合用液体培养或悬浮培养n n③③生长旺盛的愈伤组织呈乳黄色或白色，有光泽生长旺盛的愈伤组织呈乳黄色或白色，有光泽，也有浅绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变，也有浅绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色为黄色甚至褐色愈伤组织形成分化期分化期n n是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化，是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞形成的导致形成由不同形态和功能的细胞形成的愈伤组织。
愈伤组织分化期的主要表现：分化期的主要表现：n n细胞分裂部位和方向发生改变细胞分裂部位和方向发生改变n n分化组织瘤状结构和维管组织的形成分化组织瘤状结构和维管组织的形成n n体积不再减小体积不再减小n n出现各种类型的细胞出现各种类型的细胞二、愈伤组织的继代培养二、愈伤组织的继代培养n n愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营 养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养，即必须转移到新鲜培养基上培养，即继代培养继代培养n n通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不 分化的增殖状态分化的增殖状态n n由于代谢产物的积累会产生毒害作用，如由于代谢产物的积累会产生毒害作用，如果长时间不继代培养，就会使愈伤组织变果长时间不继代培养，就会使愈伤组织变成黑褐色，继而死亡成黑褐色，继而死亡n n用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保存愈伤组织的一种方法存愈伤组织的一种方法n n一般来说，愈伤组织的增殖生长只一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生发生在不与琼在不与琼 脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。
因此，由殖，只是细胞分化形成紧密的组织块因此，由 于愈伤组织的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变于愈伤组织的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变 成了一个不规则的馒头状的组织块成了一个不规则的馒头状的组织块n n它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果青苹果愈伤组织增殖培养乌桕愈伤组织增殖培养三 愈伤组织的形态发生三 愈伤组织的形态发生n n形态建成形态建成：外植体在适宜的培养条件下经：外植体在适宜的培养条件下经过脱分化和再分化形成完整植株的过程过脱分化和再分化形成完整植株的过程 n n在组织培养中，从外植体形成器官或无性在组织培养中，从外植体形成器官或无性系的形态发生，有下面两种方式：系的形态发生，有下面两种方式：n n不定芽方式不定芽方式 指愈伤组织通过再分化形成不定芽再生植指愈伤组织通过再分化形成不定芽再生植株这是组织培养中常见的器官发生方式这是组织培养中常见的器官发生方式n n愈伤组织的器官发生顺序有三种情况：愈伤组织的器官发生顺序有三种情况：（（1 1）先形成芽，再在芽的基部长出根形成小植株 ）先形成芽，再在芽的基部长出根形成小植株 （（2 2）先产生根，再从根的基部分化出芽形成小植株；）先产生根，再从根的基部分化出芽形成小植株；（ （3 3）仅单独分化根或芽，即无根的芽或无芽的根。
仅单独分化根或芽，即无根的芽或无芽的根形态发生方式（一）形态发生方式（一）形态发生方式（二）形态发生方式（二）n n胚状体方式 胚状体方式 指由培养细胞诱导分化出的指由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株完整植株四、愈伤组织形态发生的调控四、愈伤组织形态发生的调控影响因子：影响因子：n n（一）外植体本身（一）外植体本身n n（二）培养基（二）培养基n n（三）培养环境（三）培养环境n n1 1．遗传型．遗传型 材料的基因型对愈伤组织的器官材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响分化有决定性的影响n n2 2．器官和部位．器官和部位 对有些植物而言，不同的器对有些植物而言，不同的器官或组织所形成的愈伤组织，在生理上或形态官或组织所形成的愈伤组织，在生理上或形态 上存在明显差异上存在明显差异n n3 3．年龄．年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株一）外植体本身（一）外植体本身n n1 1．生长调节剂．生长调节剂 细胞分裂素细胞分裂素/ /生长素的比例是控生长素的比例是控 制芽和根形成的重要条件之一。
细胞分裂素制芽和根形成的重要条件之一细胞分裂素/ /生生 长素比例高时有利于芽形成；而这一比例低时长素比例高时有利于芽形成；而这一比例低时 ，有利于根的形成有利于根的形成n n2 2．无机营养元素．无机营养元素 营养元素的缺失会导致愈伤营养元素的缺失会导致愈伤 组织生长不良，如：组织生长不良，如：缺铁：细胞分裂停止； 缺铁：细胞分裂停止；缺氮：细胞过度生长，形成层组织减退 缺氮：细胞过度生长，形成层组织减退二）培养基（二）培养基n n3 3．有机成分．有机成分 在培养基中加入糖、各类在培养基中加入糖、各类B B族维生素、肌醇和甘氨酸等，可以促进愈伤组织的生素、肌醇和甘氨酸等，可以促进愈伤组织的生长和器官分化的要求生长和器官分化的要求n n4 4 ．物理性质 ．物理性质 培养基的物理性质（固体或液培养基的物理性质（固体或液体状态，渗透压等）对形态发生有明显的影响体状态，渗透压等）对形态发生有明显的影响 如油菜花药培养宜先在高糖（如油菜花药培养宜先在高糖（9-10%9-10%）培养）培养基中培养，有利于细胞增殖和胚状体的形成基中培养，有利于细胞增殖和胚状体的形成n n1 1．光周期 ．光周期 在愈伤组织诱导阶段，一般采用三在愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照来进种做法：全暗、周期性光照、散射性光照来进行光照调节。
行光照调节三）培养环境（三）培养环境n n2 2、温度、温度 在组织培养中，一般都采用在组织培养中，一般都采用2525± ±2 2℃℃的的恒温条件下进行外植体的培养都可较好地形成芽恒温条件下进行外植体的培养都可较好地形成芽和根器官形成胚形成菊花叶片培养愈伤组织形成五、愈伤组织的应用五、愈伤组织的应用n n(1)(1)加快了植物新品种和良种繁育速度加快了植物新品种和良种繁育速度植物组织培养将传统的育种方式改在试管和室植物组织培养将传统的育种方式改在试管和室内进行，利用一块植物组织在一年内可繁殖成千内进行，利用一块植物组织在一年内可繁殖成千上万株的小植株，取得迅速高效、低成本推广新上万株的小植株，取得迅速高效、低成本推广新品种的效果品种的效果n n(2)(2)利于种质资源保存和远距离运输利于种质资源保存和远距离运输应用组织培养保存种质资源具有节约土应用组织培养保存种质资源具有节约土地，节省人力、物力，手续简便，易于远地，节省人力、物力，手续简便，易于远 距离运。