基因的定位与克隆千奇百怪的突变体这些突变体是怎么产生的呢？突变体: 是某个 性状发 生可遗 传变异 的材料 ，或某 个基因 发生突 变的材 料水稻获得突变体的方法：1.1 自发突变 1.2 物理、化学诱变 1.3 插入突变法 ：T-DNA 插入法 ；转座子法 到底是哪个基因突变而引起对应性状的改变呢 ？？就需要进行基因定位基因定位基因定位（mapping）：是用一定的方法是用一定的方法 将基因确定到染色体上的实际位置将基因确定到染色体上的实际位置水稻中已克隆的重要基因• 水稻白叶枯病抗性基因 Xa21 • 水稻分蘖控制基因 MOC1 • 水稻脆秆控制基因 BC1 • 水稻半矮秆基因SD1 • 水稻抽穗期基因 Hd1 • 水稻糊化温度控制基因 ALK • 水稻抗稻瘟病基因Pi-b 一、连锁分析（Linkage analysis）1）概念：基因定位的连锁分析是根据基因在染色体 上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的 原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另 一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位2）重组值（recombination fraction）是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，即基因间 的遗传距离。
如果两个基因间有1%的重组值，其遗传图的距 离为1厘摩centimorgan，cM）交换值(RF)(%)=重组型的 配子数/总配子数×100%重组值越大，说明两基因间的距离越远，基因间的连 锁强度越小；重组值越小，说明基因间的距离越近，基因间 的连锁强度越大3）遗传标记（genetic marker）用连锁分析发法进行基因定位需要已知的DNA序列作为遗 传标记，这些标记按孟德尔方式遗传，标记位点应是多态的4）遗传多态性：是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位 基因，且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于1%二、三点测交(three-point testcross)与染色体作图为了进行基因定位，摩尔根和他的学生Sturtevant创造了 三点测交方法，即将3个基因包括在同一次交配中进行这种 测交，一次实验就等于3次两点试验已知在果蝇中棘眼(ec)、截翅(ct)和横脉缺失(cv)这3个隐 性突变基因都是X连锁的把棘眼、截翅个体与横脉缺失个体 交配,得到3个基因的杂合体ec ct +/+ + cv (ec、ct、cv的排列 不代表它们在X染色体的真实顺序)，取其中3杂合体雌蝇再与 3隐性体ec ct cv/Y雄蝇测交，测交后代如下表。
序号表型实得数1ec ct +2125亲本型2+ + cv22073ec + cv273单交换I型4+ ct +2655ec + +217单交换II型6+ ct cv2237+ + +5双交换型8ec ct cv3合计5318ec ct +/ + + cv× ec ct cv/Y测交后代数据结果分析1、归类2、确定正确的基因顺序用双交换型与亲本类型相比较，发现改变了位置的那个基 因一定是处于中央的位置，因为双交换的特点是旁侧基因的 相对位置不变，仅中间的基因发生变动于是可以断定这3 个基因正确排列顺序是ec cv ct亲本型ec ct + + + cv双交换型+ + + ec ct cvec ct ++ + cvec + ct+ cv +ct ec ++ + cvec + ++ ct cvec cv ct+ + +ct + ++ ec cv3、计算重组值，确定图距(1)、计算ct—cv的重组值忽视表中第一列(ec/+)的存在，将它们放在括弧中，比 较第二、三列：(ec) ct +2125非重组 (+) + cv2207 (ec) + cv273非重组 (+) ct +265 (ec) + +217重组 (+) ct cv223 (+) + +5重组 (ec) ct cv3ct—cv间重组率=(217+223+5+3)/5318=0.084=8.4%=8.4cM(2)、计算ec—cv的重组值忽视表中第二列(ct/+)的存在，将它们放在括弧中， 比较第一、三列：ec (ct) +2125非重组 + (+) cv2207 ec (+) cv273重组 + (ct) +265 ec (+) +217非重组 + (ct) cv223 + (+) +5重组 ec (ct) cv3ec—cv间重组率=(273+265+5+3)/5318=10.2%=10.2cM(3)、计算ec—ct的重组值忽视表中第三列(+/cv)的存在，将它们放在括弧中，比 较第一、二列：ec ct (+)2125非重组 + + (cv)2207 ec + (cv)273重组 + ct (+)265 ec + (+)217重组 + ct (cv)223 + + (+)5非重组 ec ct (cv)3ec—ct间重组率=(273+265+217+223)/5318=18.4%=18.4cM4、绘染色体图eccvct10.28.418.418.6在计算ec—cv和cv—ct的重组值时都利用了双交换值，可 是计算ec—ct时没把它计在内，因为它们间双交换的结果并 不出现重组。
所以ec—ct之间的实际双交换值应当是重组值 加2倍双交换值即18.4%+2×0.1%=18.6%当三点测交后代出现8种表型时,表明有双交换发生,此时 需用2倍双交换值来作校正若3个基因相距较近，往往不出 现双交换类型,后代只有6种表型,无需校正标记1标记2目标基因三、图位克隆图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆， 该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进 行基因克隆的一种方法，其原理是根据功能基因在基 因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术 对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因 紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建的基因区 域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行（ chromosome walking）逼近目的基因或通过染色体登 陆（chromosome landing）（Tanksley et al.，1995 ）的方法最终找到包含目的基因的克隆，最后通过遗 传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列 图位克隆的特点是无需预先知道基因的DNA顺序，也无需 预先知道其表达产物的有关信息，但应有以下两方面的基本 情况一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体 ,即定位群体，如：F2、DH、BC、RI等。
二是开展以下几项工作：（1）首先找到与目的基因紧 密连锁的分子标记；（2）用遗传作图和物理作图将目标 基因定位在染色体上的特定位置；（3）构建含有大插入 片段的基因组文库；（BAC或YAC）；（4）以与目的基因 连锁的分子标记为探针筛选基因组文库；（5）用获得阳 性克隆构建目的基因区域的重叠群；（6）通过染色体步 行、登陆或跳跃获得带有目的基因的大片段克隆；（7） 通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆；（8）通过 遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列M1M2构建遗传图谱构建物理图谱染色体步移： Chromosome Walking 筛选基因组文库序列分析与功能鉴定对于基因组还未测序的物种可通过染色体步移的方法进行定位，但是 比较费时费力，而对于水稻、拟南芥等基因组测序工作已经完成的物 种，则不在利用染色体步移的方法进行定位，直接从构建遗传图谱到 构建物理图谱，最后确定目标基因的候选基因，再通过互补实验进行 验证四、分子标记n分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列 变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态 性的直接的反映n现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用 于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种 亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方 面。
分子标记的种类 n一、基于分子杂交技术的分子标记技术：限制性片断 长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) n二、基于PCR技术的分子标记技术：① 随机扩增多态 性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )② 简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)n三、基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记 ：① 扩增 片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP ) n四、基于DNA芯片技术的分子标记技术 ：核苷酸多态 性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP) SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组 成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较 短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、 （GGC）n等重复不同遗传材料重复次数的可变性，导致了 SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础 尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端 序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设 计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列 扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即 SSR标记。
SSR五、基因初步定位目的基因的初步定位(mapping the target gene)是利 用分子标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基因 定位于染色体的一定区域内初定位通常使用近等基因系法(near-isogenic lines, NILs)或群组分离分析法(bulk segregant analysis, BSA) n近等基因系是指只有目标性状基因有差异，其它性状基因 相同的2个群体，可以通过连续回交的途径获得n由于近等基因系需要连续的回交，所需的时间较长，因此 Michelmore等(1991)提出了群组分离分析法（BSA法）， 将分离群体中研究的目标性状根据其类型(如抗病、感病) 分成2组，将每组内一定数量的植株DNA 等量混合，形成 两个池，这两个池仅在目标性状(如抗病性)上有差异利 用分子标记技术寻找两个池的扩增谱带的差异，这种多态 性极可能与目标基因连锁再用所有的分离后代单株，验 证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离的确定六、精细定位在初步定位基础上，设计并筛选离亲本更近 且在两亲本之间表现多态性的引物，然后利用F2 群体中的突变体检测筛选到的亲本间多态性引物 ，逐步缩小范围，将目的基因定位到染色体上一 个很小的物理区间内。
举例说明：利用SSR标记进行水稻 drawf1基因的定位基本实验方法nF2定位群体构建n植物总DNA的提取nPCR反应n聚丙烯酰胺凝胶电泳n引物设计F2群体构建引物设计常用软件及网站设计软件： primer3.0 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_ww。