实验二 脲酶的分离【实验目的】掌握凝胶层析分离纯化蛋白质的方法与原理【实验原理】凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之分子筛层析其固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同；也就是蛋白质的大小不一，凝胶上有大小不一的孔；大的蛋白质在凝胶中不进入孔内直接下来，速度最快，中等大小的进入大孔中，下来速度较慢；小的蛋白质则进入大小孔中，下来速度最慢凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等它的突出优点：不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处对于高分子物质有很好的分离效果凝胶的种类有很多，包括葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，株状琼脂糖凝胶等根据实验目的的不同选择不同型号的凝胶脲酶分子量较大，达480kDa脲酶粗制品通过交联葡聚糖Sephadex G－200层析柱进行分离酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的脲酶活性测定，根据脲酶催化尿素水解释放氨和CO2的反应：【实验操作】1. 样品的制备称取1g刀豆粉，加入32%丙酮5ml，振摇10min，倒入离心管中，用1ml 32%丙酮洗小三角烧瓶一次，也倒入离心管中，然后3000rpm离心5min。
吸取上清液，加入4倍体积的冷丙酮，3000rpm离心5min弃掉上清液，取沉淀，待沉淀中的丙酮蒸发后加入0.8ml H2O，即为我们的脲酶粗提液2. 装柱先向柱中加入少量水，留部分水于玻璃管中，关闭出口，检查是否通畅摇匀三角瓶中的凝胶，自顶部将凝胶缓慢加入柱内，使凝胶上升，待底部凝胶沉积到1~2cm时，打开出口，此间不能使胶面露出然后调节凝胶床面上的水柱高度保持在10cm左右3. 加样、洗脱、收集首先将出口打开，使床面上的蒸馏水缓慢下流，达到床面将近露出为止，关紧出口然后用吸管吸取0.6ml脲酶粗提液，缓慢地沿着层析柱内壁加于床表面，再用滴管小心加入1ml水，使之进入床面接着开始洗脱，接上贮液瓶，进行洗脱，流出的液体分别收集在小离心管控制流速3ml/15min，收集量3ml/管4. 检测1）蛋白质检测：①上样稀释液: 脲酶粗提取液0.1ml+蒸馏水 稀释20倍②所有收集管编号③280nm测定光密度，乘以0.75为蛋白质含量(mg/ml)2）脲酶活性的检测：①酶促反应 空白洗脱液（各管编号）上样稀释液3%尿素（ml）0.50.50.50.1mol/L磷酸缓冲液 pH6.8（ml）1.01.01.037℃保温5min酶液（ml）-0.50.5无离子水（ml）0.5--37℃保温15分钟，保温结束，各管中立即加HCl 0.6ml。
②显色反应 空白洗脱液（各管编号）上样稀释液酶促反应液（ml）0.50.05~0.50.05~0.10无离子水（ml）2.52.95~2.52.95~2.903%阿拉伯胶（滴）222充分混匀Nessler试剂（ml）0.750.750.75立即混匀，在分光光度计480nm波长比色测定其光密度各管用量：A280酶促反应液（ml）<0.10.50.1~0.20.40.2~0.30.30.3~0.40.20.4~0.50.1>0.50.055.计算根据测得的实验管的光密度，从标准曲线查得氨的微克分子数 。