酵母菌液态深层通风发酵一、 实验目的1、 了解通风搅拌罐的发酵过程2、 学习发酵过程各生理指标的测定二、 实验器材1分光光度计2发酵罐2.1罐体系统罐身：由硼硅玻璃和不锈钢加工制成密封件：机械密封、硅橡胶“O”型圈2.2罐盖布局阀门系统示意图（背面）测温电极（1）蒸汽回汽管火菌罩进蒸汽阀冷却水电磁阀夹套溢流管、阀冷凝器进水阀夹套进蒸汽阀排水抻湿阀总进蒸汽口冷却水进口2.2.1控温夹套控温夹套由控温夹套、1—加热器、2—测温电极、3—水位电极等组成2.2.2灭菌罩灭菌罩（参见图1）由不锈钢罩体、AQ一安全阀、P2-压力表、17-测温电极（3） 等组成2.2.3管阀系统管阀系统（参见图1）由EW—冷却水电磁阀、7一冷凝器进水阀、W1-溢流水阀、 W2—排水排汽阀、S—灭菌罩进蒸汽阀、S2—夹套进蒸汽阀、25—蒸汽回汽管、 G-气路调节阀、不锈钢管路、优质胶管、接头等组成2.2.4辅助设备：由空气压缩机、蒸汽发生器组成辅助设备属于选购设备2.2.5系统安装：•发酵罐应安装在通风良好、空气洁净的房间，房间内应经常消毒•将罐体与控制电箱放置在平整桌面上，调节支撑脚确保水平与垂直度•连接进水、排水、空气进气管，并用卡箍固定挟紧，进水端要加水过滤器。
•将搅拌电机、PH电极、DO电极、泡沫电极、测温电极、水位电极、加热器、 电磁阀的电缆接头连接好•接插好黄绿接地线，保证罐体有良好的接地!2.3发酵罐电气系统（图3）2.3. 1开机和关机（参见图3）在确认发酵罐管路部分和电气部分连接无误后，方可开机进行操作！开机顺序：接通电源，待控制柜上红色电源指示灯亮后再打开控制柜右下方 的红色电源开关，（注意：红色电源指示灯亮后表示控制柜的接线柱电源端子已 有电，千万不可用手触摸该接线端子，以防发生触电事故！）然后打开控制柜右 侧的工控机电源开关启动工控机；进入windows桌面后点击组态王程序并继续进 入发酵程序后暂停操作；（关于发酵控制程序的操作请另见发酵控制系统操作说 明书）根据实际需要分别打开控制柜右侧的搅拌电机、加热器和蠕动泵、电磁 阀的电源开关；（工控机电源和搅拌电机、加热器、蠕动泵包括电磁阀的电源开 关是分开安装的，如果不需要运行这些部件，则相应的电源开关可以关闭，在此 情况下，工控机仍可以开机运行，但不能驱动执行机构）然后继续进行发酵控制 参数的设定，（关于发酵控制程序的设定请另见发酵控制系统操作说明书）待所 有控制参数设定完毕并确认无误后再根据要求选择点击各操作界面上的自动或 手动运行按钮进入发酵培养。
特别注意：搅拌电机的电源必须在发酵程序运行前 打开，否则可能会造成搅拌电机飞车，损毁搅拌系统关机顺序：关机时必须先点击各操作界面上的停止按钮，确认所有控制项目全部 停止后再点击返回按钮回到主菜单界面退出发酵程序；继续退出组态王程序后再 退出windows，关闭工控机电源并关闭红色电源开关，（此时控制柜上红色电源 指示灯亮着，控制柜的接线柱电源端子仍然带电）最后切断电源，（此时控制柜 上红色电源指示灯熄灭）三、 试剂（1） 1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏 水，加热中依次加入NaOH 5 g，3, 5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠 0.25 g，搅拌至溶冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存2） 10%蔗糖溶液（3） NaOH 1mol/l（4） 乙酸缓冲液（0.05mol/ml） pH5.0四、 操作方法1. 灭菌准备工作•将排水硅胶软管装在排水排气口上•打开排水排汽阀，放尽控温夹套内的剩余水•关闭溢水阀、冷凝器进水阀、灭菌罩进蒸汽阀、夹套进蒸汽阀、蒸汽回汽管堵 头和进空气阀•拔下泡沫电极、液位电极和顶盖接地线的连接插头。
•取出pH、DO电极进行校验，校验完毕后卸下备用该步骤在实罐灭菌时操作） •取出测温电极•拧下冷凝器进、出水接头•将进气过滤器、尾气过滤器、尾气滤水瓶安装到位•取样放料装置安装就位•将补料瓶安装上呼吸过滤器•打开蒸汽发生器准备提供蒸汽2. 空罐灭菌第一步：装上pH电极孔、DO电极孔、三针补料口的堵头并拧紧第二步：旋松搅拌电机固定螺栓，卸下电机连接电缆，取下电机，横放在柔软、干燥桌面上注意电机和电缆的连接口不能进水，以免发生短路！第三步：卸下温度电极，拧下蒸汽回气管堵头，盖上灭菌罩，拧紧固定螺丝，插 上测温电极第四步：点击系统运行进入组态王发酵程序主菜单后选择灭菌辅助程序，设置灭 菌温度与灭菌时间，点击开始按钮进入灭菌程序运行第五步：打开排水排气阀，打开灭菌罩进蒸汽阀，然后缓缓打开蒸汽发生器的出 蒸汽总阀让蒸汽不断进入罐内，使罐体温度不断升高操作时应密切注意灭菌罩 上的压力表指示和控制箱上的温度指示，保证压力不超过0.15Mpa，温度不超过 130°C第六步：当设定的灭菌时间到时，控制柜发出鸣叫报警，此时将蒸汽总阀和灭菌 罩进蒸汽阀关闭第七步：当确认罐压释放完毕后，将排水排汽阀完全打开，排空夹套内的冷凝水。
第八步：灭菌罩温度下降到90C时卸下灭菌罩的固定螺栓，小心取下灭菌罩， 拧上蒸汽回气管堵头，空消完成3. 实罐灭菌空罐灭菌后，应尽快进行实罐灭菌发酵罐倒入3.0L的如下成分的培养基：发酵培养基：蔗糖20.0g/L蛋白胨5.0 g/LNa2HPO44.0 g/LMgSO40.5 g/LKH PO2 41.0 g/LpH4.5~5.5第一步：装上己校正好的pH、DO电极并旋上保护盖打开排水排汽阀，关闭灭 菌罩进蒸汽阀、冷水阀、冷凝器进水阀、进空气阀、夹套溢流阀、拧上蒸汽回气 管堵头第二步：放入发酵培养液，检查并拧紧顶盖上所有的连接口，不得有泄漏第三步：连接好尾气过滤瓶并在尾气排放口接上呼吸过滤器，将进气口、取样口、 补料口各胶管弯曲夹紧第四步：打开工控机电源开关，选择灭菌辅助程序，打开搅拌电机电源开关，设 置灭菌温度与灭菌时间第五步：打开排水排汽阀，缓缓打开蒸汽发生器的蒸汽总阀，打开夹套进蒸汽阀， 让蒸气不断进入夹套内，适时调整排水排汽阀和夹套进蒸汽阀，使罐体温度不断 升高直到升到120°C（注意对应压力）操作时应密切注意灭菌罩上的压力表 指示和控制箱上的温度指示，保证压力不超过0.2Mpa，温度不超过130C。
第六步：当设定的灭菌时间到时切断蒸汽发生器的电源等蒸汽压力释放，罐体 自然冷却当罐内温度降到90C以下，确认罐内压力释放完毕后，将排水排汽 阀完全打开，排空夹套内的冷凝水卸下测温电极的插头，取下灭菌罩，拧上蒸 汽回气管堵头，将排水排汽阀关闭，实消完成4. 培养4.1准备工作第一步：关闭排水排汽阀，打开溢流水阀，连接好冷凝器进出水管并拧紧第二步：关闭气路调节阀，连接空气压缩机与发酵罐的进气端第三步：调整压力调节阀（空压机端）将压力调整至0.1-0.15MPa第四步：将进气过滤器与压力表用专用气管连接并用喉箍箍紧第五步：开气路调节阀，然后松开进气、尾气口胶管夹头，将气量调节至工艺所 需的流量第六步：安装好搅拌电机和顶盖接地线第七步：插入测温电极；取下DO、pH电极上的保护盖；连接pH电极、DO电极、 泡沫电极和电机的连接电缆第八步：进入发酵程序，设置运行参数，打开需要运行的搅拌电机、加热器、电 磁阀、蠕动泵的电源开关，点击各运行界面的自动或手动按钮进入发酵培养4.2接种培养第一步：准备好的种子液300ml第二步：酒精盘内放入无水酒精或酒精棉，点燃后安放于接种口，适当加大通气 量或减小尾气流量。
第三步：打开接种盖，将其放入干净器皿中第四步:将菌种瓶口放在火焰上烧一下，并在火焰上拔下瓶塞将菌种倒入发酵罐 第五步：将接种盖放在火焰上烧一下，盖上接种盖第六步：按工艺要求恢复正常的罐压和通气量5检测5.1在发酵过程中有pH电极、溶氧电极记录发酵情况；5.2发酵前后通过取样在660nm下检测发酵液中细菌浓度的变化；5.3总糖测定：总糖标准曲线制作：显色液制备：将50ml浓硫酸缓缓加入10ml水中冷却至室温，加入0.6g苯酚晶体搅拌使 其溶解配成显色液标准葡萄糖溶液制备：各配置0.1 mg/ml、0.15 mg/ml、0.2 mg/ml、0.25 mg/ml、0.3 mg/ml葡萄 糖溶液各取上述葡萄糖浓度溶液1ml，分别加5.00ml显色液，震荡混匀置于沸水浴中 保温30〜35min，取出，放在冷水浴中，冷却至室温与4 9 0 n m处测定其吸 光度值，将OD值为纵坐标与葡萄糖浓度为横坐标做图样品测定：取1.00ml的待测样品于试管中，加入5.00ml显色液，震荡混匀置于沸水 浴中保温30〜35min，取出，放在冷水+浴中，冷却至室温与4 9 0 n m处测 定其吸光度值所测得的OD值回归上述标准曲线，计算得出发酵液总糖含量。
5.4蔗糖酶产量测定收集发酵液，离心，收集细胞，经过醋酸缓冲液两次洗涤，超声波破碎离 心收集上清液表1酶液的酶活力比色管号1234酶液1 mL1 mL1 mL1 mL醋酸buffer1mL1 mL1 mL1 mL1 mol/L NaOH1 mL000蔗糖溶液1 mL1 mL1 mL1 mL30°C准确反应10 min1 mol/L NaOH0mL1 mL1 mL1 mL水杨酸试剂1 mL1 mL1 mL1 mL沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mLA 540附图：葡萄糖标准曲线五、 注意事项发酵罐的灭菌注意安全六、 思考题1、 火焰接种时，我们为什么要关闭尾气的排放，同时，加大通风量？2、 在实罐灭菌结束后，在降温过程中，为什么我们没有等温度降到室温，而是在80-90度时，就通了无菌空气？3、 生物量的测定除了我们这里的测定方法外，还可以用哪些方法？4、 糖的测定还有哪些方法？。