博士论文：醛缩酶A作为肝癌治疗新靶点的实验研究及活性当归多糖的筛选 前 言 肝癌作为病死率最高的恶性肿瘤之一，在我国每年导致约 38.3 万人口死亡，在全球肝癌死亡人口数中所占比例高达 51%[1]相较于机体正常细胞，肿瘤拥有自我增殖能力、凋亡抵抗、无限的复制潜能，和对抗生长信号的不敏感性、并且其持续的血管生成能力、组织侵袭转移能力和糖酵解能力非常强这些特性使得肿瘤细胞在生存和侵袭方面具有极大优势，因而对人类健康危害巨大且难以攻克肿瘤细胞的七个特性的发现对于肿瘤研究与治疗来说意义重大，其中较强的糖酵解能力作为肿瘤的重要特性，引起了越来越多研究者们的注意肝癌的发生机制众多，其中代谢异常被认为是一个重要因素，尤其是其代谢酶的变化而引起的能量代谢的异常1927 年，Warburg 观察到相比于正常细胞，即使在氧气充足的情况下，肿瘤细胞通过糖酵解途径代谢更多的糖，产生大量乳酸在癌细胞中，糖酵解作用取代了有氧循环而成为主要供能途径，这种现象称作瓦氏效应[2]目前这种有氧糖酵解代谢方式在多种肿瘤中已证实存在，如肾癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等[37]醛缩酶（EC4.1.2.13，Aldolase，ALDO）是糖酵解和糖异生途径中的一个重要代谢酶，从而调控机体能量代谢过程。
[8]现有研究提示，部分肿瘤病人血清中醛缩酶a (Aldolase a，ALDOA) 表达明显增高，提示 ALDOA 可能在肿瘤发生发展中扮演重要角色[911]但目前 ALDOA 与肿瘤发展的关系尚不清楚，ALDOA 能否成为肿瘤诊断指标、其抑制剂能否成为抑制肿瘤生长与转移的候选化合物，还有待证实 当归为著名中药，是伞形科植物 Angelica sinensis (Oliv.) Diels 的干燥根，在《本草纲目》和《神农本草经》中均有记载主要产地为甘肃、四川、云南、陕西等，因其味甘、辛而性温质润，通常具有补血活血、调经止痛和润肠通便的作用近年来，随着对当归成分研究的深入，运用物理、化学等多种技术手段对其进行分析，分离得到了酚类、有机酸类、维生素、氨基酸类、糖类、挥发油等多种生物活性化合物成分，为当归的物效研究奠定了基础[12, 13]当归多糖，因其在促进造血[14]、抗肿瘤[15]、抗氧化[16]、抗溃疡[13]和防辐射[17]等多个方面所具有的药理活性，逐渐成为当归药效成分研究的热点本课题组前期对当归多糖进行了初步研究[18]，发现当归总多糖对 ALDOA 有明显抑制作用本课题旨在通过对 ALDOA 与肿瘤发生、转移机制相关性的研究，初步确定无氧代谢过程中 ALDOA 与肿瘤生长代谢之间的关系，并以 ALDOA 为靶点筛选当归活性多糖，为抗肿瘤药物的研发奠定基础。
......... 文献回顾 肿瘤细胞存在代谢异常的这个现象被发现已久，有氧糖酵解被认为是肿瘤细胞所特有的代谢方式[19]早在 1927 年，Warburg 等[20, 21]观察到快速增长的肿瘤细胞，不管氧气的可用性而始终维持较高的糖酵解率来进行 ATP 的生成，并且肿瘤组织代谢的葡萄糖是正常组织的十多倍，同时乳酸的产量比正常组织多两倍因此，他们提出了肿瘤代谢采用有氧糖酵解的假说，并获得了 1931 年诺贝尔奖目前这种有氧糖酵解代谢方式在多种肿瘤中已证实存在，如肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等[37]在正常组织中，绝大多数非增殖性分化细胞通过氧化磷酸化（Oxidativephosphorylation，OXPHOS）来生产三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）供能这些细胞在细胞质中将葡萄糖代谢为丙酮酸，然后通过三羧酸循环将丙酮酸氧化，通过 ATP 合酶产生 ATP，这个过程需要有氧呼吸提供的氧气相反，快速增殖的肿瘤细胞以比正常细胞更高的速率消耗葡萄糖，即使在氧气充足条件下，也始终通过糖酵解方式将其转化成乳酸盐[22]，这个现象被称为"Warburg 效应";或"有氧糖酵解";。
1 肿瘤有氧糖酵解 在氧的存在下，大多数细胞主要代谢葡萄糖至糖酵解中的丙酮酸，然后完全氧化大多数这种丙酮酸通过线粒体 TCA 循环到二氧化碳，其中氧是最终的受体并产生电化学的电子传递链梯度以促进 ATP 生产在这些过程中，每完全氧化一个葡萄糖分子，氧化磷酸化过程能产生 34 分子 ATP， 而糖酵解过程只产生 2 分子 ATP[23]这提出了一个问题：尽管糖酵解能量生产效率低下，为何还采用这种能量代谢方式呢?随着越来越多关键致癌因素的揭露，表明信号通路的改变都趋向于适应肿瘤细胞的代谢以支持其生长和存活此外，其中一些代谢的改变似乎是恶性转化所必需的在肿瘤细胞代谢方面，多重分子机制，包括内在的和外在的，都趋向于改变细胞核心代谢方式，以满足细胞分化的三个方面基本需求：快速的 ATP 生成以维持能量供应；增加大分子的生物合成；收紧并维持适当的细胞氧化还原状态为了满足这些需求，肿瘤细胞必须通过调节自身能量代谢方式，摄取更多的葡萄糖去获得四类大分子，即碳水化合物，蛋白质，脂质和核酸[24]并且细胞外乳酸的堆积，可使肿瘤细胞局部环境保持酸性，促进肿瘤细胞对周围组织的侵袭再者，增强的磷酸戊糖旁路途径活性，使得还原型辅酶Ⅱ（Triphosphopyridine nucleotide，NADPH）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的产量增加，两者可以增加肿瘤细胞对氧化损伤和一些化疗药物的抵抗[25]。
自 2011 年以来，这种肿瘤细胞内的代谢重编程是癌症的标志进一步被广泛认可[26]目前，大量证据表明，被激活的癌基因，未被激活的肿瘤抑制因子和转录因子都直接或间接地与细胞代谢重编程相关[24]，由此在基因改变和异常的葡萄糖代谢表型之间建立起了联系[27]糖酵解途径是由十多种酶或酶复合物催化的一系列代谢反应，多种酶的表达被证明在肿瘤细胞中有所增加最新研究表明多种糖代谢酶在肿瘤细胞中除了糖酵解功能外还发挥着其他作用，影响着肿瘤细胞许多其他功能例如作为核因子在核内进行脱氧核糖核酸（DNA）的修复以及核转录，从而介导细胞凋亡，解毒，细胞周期控制等[28] .......... 2 肿瘤与 ALDOA 表达 ALDO，即 1.6二磷酸D果糖醛缩酶（Ec 4.1.2.13）在脊椎动物中，ALDO家族由结构上非常相似的基因编码的三种同功酶组成：ALDOA，属于肌肉和红细胞亚型；ALDOB，属于肝，肾和肠亚型；ALDOC，属于脑和神经系统亚型[29]随着哺乳动物所处不同的发育阶段，其体内组织 ALDO 的表达也会不同在大鼠和人类胎儿的胚胎期， ALDOA 在肝脏为主要表达亚型，然后 ALDOB 表达量逐渐增加，当肝脏慢慢分化完善后，ALDOC 的表达将完全消失，同时 ALDOA 也快速减少，ALDOB 成为了正常成年动物肝脏中的主要表达亚型。
ALDO 属胞质酶，在糖酵解和糖异生过程中起着重要作用，能催化果糖1,6二磷酸（Fructose1, 6diphosphate，FDP）和果糖1磷酸（Fructose1phosphate，FIP）为底物的裂解，与葡萄糖和果糖代谢关系密切在细胞质中，葡萄糖通过糖酵解途径酶促代谢为 FDP，后者随后被 ALDOA 催化形成 3磷酸甘油醛（Glyceraldehyde 3phosphate，GA3P）和磷酸二羟丙酮（Dihydroxyacetone phosphate，DHAP）[30]另一方面，来源于饮食或通过多元醇途径，在醛糖还原酶和山梨醇脱氢酶的作用下，从葡萄糖转化的果糖可以被果糖激酶磷酸化为果糖1磷酸（Fructose1phosphate，F1P），然后被 ALDOB 切割以产生 GA3P 和 DHAP尽管 ALDO 在代谢中的作用已经确立，但是对于该酶的许多替代功能有越来越多的相关证据尤其是 ALDO 与糖酵解酶无关的各种蛋白质的相互作用，包括细胞骨架蛋白如 F肌动蛋白，威奥综合征蛋白（WiskottAldrich syndrome protein, WASP）和微管蛋白 ALDO 还与其他类型的蛋白质相互作用，例如参与囊泡和细胞内运输质子泵的蛋白质，并且对于通过非糖酵解途径增殖癌细胞至关重要[31]。
ALDOA 在诸多癌症中过表达，如鳞状细胞肺癌和结肠癌最近报道 ALDOA 可作为结直肠癌发展的预后标志，在疾病的第 I 和 IV 阶段高表达[32]ALDOA 不仅在糖酵解中起着重要作用，还参与到细胞其他功能中，如信号转导，囊泡转运，细胞运动等研究表明，ALDOA 可与参与细胞分裂期胞质分裂的纤维状肌动蛋白相互作用因此，ALDOA 基因敲除细胞的细胞增殖减少此外，ALDOA 也可能参与到细胞内其它信号通路中，如与细胞生长代谢相关的转录因子相互作用从而引起肿瘤细胞内的代谢重编程，继而激活促癌基因同时抑制抑癌基因，最终影响了肿瘤细胞的生长[28]低氧诱导因子 1α（Hypoxiainducible factor 1α，HIF1α）作为转录因子，可以调控多个糖酵解酶相关的基因[33]研究表明[34]，HIF1α 可上调肿瘤细胞中 ALDO 亚型的表达，从而增强其糖酵解代谢由于受 O2水平影响，非转移性肿瘤细胞株中仅在低氧环境下可使 HIF1α 和糖酵解酶表达上调，而转移性肿瘤细胞株中始终高表达HIF1α 和糖酵解酶系多个糖酵解酶及其其相关转运蛋白的高表达，使得肿瘤糖酵解代谢增强，这很可能是引起肝癌中 ALDOA 表达上调的原因。
第三章 ALDOA 对肿瘤细胞转移和体内、外增殖能力的影响 ..............42 1. 实验仪器与试剂 ............ 42 2 方法 ......... 45 3 实验结果 ............. 48 4 讨论 ......... 56 第四章 以 ALDOA 为治疗靶点的抗肿瘤当归多糖的初步筛选 .............57 1 实验仪器与试剂 ............. 57 2 方法 ......... 59 3 实验结果 ............. 61 4 讨论 ......... 64 4 讨论 由于活性天然产物显著的抗癌作用，从中开发筛选高效低毒的新药或先导化合物受到国内外广泛重视，对其作用机理的研究也日益深入目前，来源于天然产物的抗肿瘤药物有紫杉醇、喜树碱、活性肽、萜类和多糖等其中，天然多糖因其疗效肯定、毒副作用小等特点拥有广阔的开发前景，已成为热门研究领域本课题组所使用的多糖为本科室前期实验提取分离得到本部分初步筛选出了能调控 AIDOA 表达的具有抗肿瘤作用的当归多糖，作为 ALDOA 潜在的抑制剂，可进一步研究其抗肿瘤效力目前尚无明确的 ALDOA 抑制剂[34]，若能进一步明确当归多糖对于 ALDOA 的抑制作用机制，对于多糖药物的体内作用靶点阐明将有重要的意义。
近几十年来，人们对于多糖的研究更加深入，对其抗肿瘤作用的认识更加全面，从而总结出了对于多糖抗肿瘤作用与其活性结构之间的关系的相关规律早在1992年，Demleitner等[98]就提出，(1→3)-β-glycosidic连接的葡聚糖骨架是抗肿瘤活性作用多糖所必需的随后，Wasser[99]的发现进一步印证了这个观点，研究表明大部分具有抗肿瘤活性的多糖属于β-葡聚糖，且它们在葡聚糖的结构上具有(1→3)-β-D-glucan主链. .......... 小 结 近。